外周血miR-571水平對肝纖維化的診斷價值

唐娟 李燚 翟麗瓊 劉邵雯 申涌 叢碩 劉詠梅

1貴州醫科大學醫學檢驗學院 （貴陽 550025）；2貴州醫科大學地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室（貴陽 550004）；3貴州省第三人民醫院檢驗科（貴陽 500002）；貴州醫科大學附屬醫院4臨床檢驗中心，5輸血科（貴陽 550004）

肝纖維化是由多種持續性肝臟炎癥導致的彌漫性細胞外基質沉積，早期肝纖維化患者癥狀不明顯，但隨著疾病進展，最終可能威脅患者生命［1-4］。尋找科學有效的早期檢查方法進行診斷并采取對應干預措施，對改善患者預后至關重要。目前組織病理學檢查是診斷肝纖維化的“金標準”，但由于侵入性操作，臨床運用存在一定局限性［5］。常用的無創診斷方法主要包括實驗室指標（預測模型）和影像學檢查等［6-7］。但影像學檢查操作重復性較差，而單一指標診斷肝纖維化效能不佳，因此多指標聯合診斷成為新的趨勢［8］。

MicroRNAs（miRNAs）可能影響慢性肝病的進程［9-10］。MiRNAs是一類小的（約22個核苷酸長）的非編碼RNA，miRNAs轉錄后通過靶向mRNA參與細胞發育、分化、增殖和凋亡以及影響代謝、癌變和病毒感染等多種過程來調控基因表達［4，11］。MiRNA與HBV復制、持續感染以及肝細胞損傷和肝纖維化進展密切相關［12］。當肝源性miRNA在肝臟損傷或發生病變被釋放到血液中時，外周血中miRNA水平升高，這時可通過實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測到。既往研究發現miR-571與肝硬化病程進展密切相關［12］，據此推測miR-571表達水平能否作為肝纖維化診斷的有效預測指標，目前未有相關研究報道。因此，本研究旨在探討外周血miR-571對肝纖維化的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2022年12月至2023年9月貴州醫科大學附屬醫院收治的肝纖維化患者40例、肝炎患者40例和同期體檢健康對照人群40例。其中健康對照組中男25例，女15例，年齡（47.23 ±14.72）歲；肝炎組中男21例，女19例，年齡（41.95± 13.89）歲；肝纖維化組中男21例，女19例，年齡（55.15 ± 12.71）。所有研究對象及家屬知情且同意，研究獲得貴州醫科大學附屬醫院研究倫理委員會批準，編號：［2019倫審第（182）號］。

1.2 納入及排除標準肝纖維化和肝炎納入標準：（1）年齡18 ～ 85歲；（2）符合2019版《慢性乙型肝炎防治指南》［13］；（3）經病理學確診為肝纖維化。排除標準：（1）臨床資料缺失；（2）肝移植術后；（3）肝癌；（4）近期服用過抗凝相關藥物。健康人群對照納入標準：（1）近1個月體檢正常者；（2）年齡18 ～ 85歲。排除標準：（1）妊娠及哺乳期婦女；（2）患有肝臟腫瘤或其他類型肝病；（3）合并其他嚴重臟器疾病；（4）近期服用過抗凝相關藥物。

1.3 方法檢測肝纖維化組、肝炎組和健康對照組外周血miR-571表達水平：取外周血3 mL，采用Trizol試劑提取盒（北京索萊寶科技有限公司）提取總RNA，并使用超微量分光光度計（美國Thermo公司，NanoDrop 2000C型）檢測RNA濃度。以總RNA做為模板，使用miRNA逆轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）和miR-571特異性莖環逆轉錄引物（上海生物工程股份有限公司）進行逆轉錄（美國Thermo公司，ProFlex?型）。將逆轉錄所得cDNA，采用SYBR RT-qPCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）對miR-571進行檢測，反應條件：95 ℃ 3 min預變性，95 ℃30 s，60 ℃ 40 s，共35個循環。采用2-ΔΔCt法計算miR-571相對表達量，選擇U6作為內參，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

表2 臨床資料表Tab.2 Baseline characteristic of participants ±s

表2 臨床資料表Tab.2 Baseline characteristic of participants ±s

注：APRI評分 =［（ALT）/（ALT參考值上限）］/（PLT）×100；FIB-4指數=年齡×AST/ PLT計數×ALT

指標ALT（U/L）AST（U/L）PLT（× 109/L）APRI評分（分）FIB-4指數P 值0.001 0.014＜ 0.001 0.008＜ 0.001健康對照組（n = 40）25.24 ± 16.26 22.51 ± 13.62 233.68 ± 48.87 0.29 ± 0.18 0.19 ± 0.08肝炎組（n = 40）37.28 ± 28.07 40.62 ± 45.52 184.90 ± 154.32 0.79 ± 0.94 1.57± 1.25肝纖維化組（n = 40）57.21 ± 56.05 38.41 ± 46.32 124.92 ± 76.96 1.70 ± 3.34 3.59 ± 4.31 H值4.553 7.693 11.084 5.476 27.158

同時采用羅氏貝克曼庫爾特AU5800自動生化分析儀檢測各組血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）等指標水平。用Sysmex XN9000自動血液分析儀檢測抗凝全血中的血小板計數（PLT）。

1.4 主要觀察指標比較肝纖維化組、肝炎組和對照組中AST、ALT、PLC、FIB-4指數、APRI評分和miR-571水平；分析miR-571水平與其他臨床指標的的相關性；logistic回歸分析尋找肝纖維化獨立危險因素；ROC曲線分析miR-571水平診斷肝纖維化顯著性。

1.5 統計學方法使用SPSS 26.0統計軟件，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用多獨立樣本Kruskal-Wallis檢驗。使用Spearman進行相關性分析。為了確定肝纖維化的獨立危險因素，將單因素邏輯分析中P＜ 0.05的變量納入多因素邏輯回歸。構建受試者工作特征（ROC）曲線用于預測肝纖維化患者的潛在生物標志物，ROC曲線下面積（AUC）用于評估診斷生物標志物的準確性，以P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者臨床資料比較肝纖維化組的ALT、APRI評分和FIB-4指數均高于健康對照組和肝炎組，同時PLT低于其余兩個組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。肝炎組的AST高于其他兩組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。

2.2 外周血miR-571表達水平對比健康對照組、肝炎組和肝纖維化組外周血miR-571的表達水平見圖1A，結果顯示，肝纖維化組miR-571相對表達量為2.004（0.030，4.260）顯著高于健康對照組和肝炎組0.704（0.040，2.670），0.500（0.060，1.100），組間比較差異有統計學意義（P＜ 0.000 1）。肝炎組和健康對照組miR-571的表達水平組間比較差異無統計學意義。將肝炎組和健康對照組合并為非纖維化組，結果顯示，見圖1B，非纖維化組和纖維化組miR-571的表達水平比較差異有統計學意義（P＜ 0.000 1）。

圖1 外周血miR-571表達水平對比Fig.1 Comparison of miR-571 expression levels in peripheral blood

2.3 外周血miR-571表達水平與AST、ALT、PLT、APRI評分和FIB-4指數相關性分析Spearman分析結果顯示，miR-571水平與AST無明顯相關，與ALT、APRI評分和FIB-4指數呈正相關（r= 0.23、0.30、0.22，P＜ 0.05），與PLT呈負相關（r= -0.19，P＜ 0.05），見圖2。

圖2 MiR-571表達水平與臨床指標相關性分析Fig.2 MiR-571 expression level and clinical correlation index analysis

2.4 單因素多因素Logistic回歸分析將年齡、性別、AST、ALT、PLT、APRI評分、FIB-4指數以及miR-571水平進行單因素logistic回歸分析，在α=0.05的水平上篩選肝纖維化發病的危險因素。結果顯示年齡、ALT、PLT、APRI評分、FIB-4指數以及miR-571水平等6個因素具有統計學意義。進一步剔除混雜因素，建立多因素logistic回歸模型，結果提示FIB-4指數和miR-571是肝纖維化的獨立危險因素，見表3。

表3 肝纖維化的單因素和多因素Logistic回歸分析Tab.3 Hepatic fibrosis logistic regression analysis，involving univariate and multivariate

2.5 ROC曲線結果ROC曲線結果顯示，當miR-571的截斷值為0.80時，其診斷纖維化的AUC為0.91（95%CI：0.85 ～ 0.96），敏感度和特異度分別為97.50%和77.50%；當FIB-4指數的截斷值為0.48時，其診斷纖維化的AUC為0.83（95%CI：0.76 ～ 0.90），敏感度和特異度分別為97.50%和56.25%；使用miR-571和FIB-4指數聯合診斷時，當截斷值為-1.75時，其診斷纖維化的AUC為0.942（95%CI：0.90 ～ 0.98），敏感度和特異度分別為95.00%和95.00%，見圖3和表4。

圖3 miR-571和FIB-4指數診斷肝纖維化的ROC曲線圖Fig.3 ROC curves of miR-571 and FIB-4 index for diagnosis of liver fibrosis

表4 FIB-4指數和miR-571診斷肝纖維化的ROC 曲線結果Tab.4 ROC curve results of FIB-4 index and miR-571 in the diagnosis of liver fibrosis

3 討論

miR-571位于人類第4號染色體上，有研究［12，14］發現，miR-571參與肝纖維化以及肝硬化的發生發展，在肝纖維化組織和TGF-β刺激的肝星狀細胞中表達升高，可通過Notch通路促進肝星狀細胞的增殖和遷移同時抑制細胞凋亡。但目前未有具體研究表明外周血miR-571增高的相關機制，基于既往研究推測，細胞內穩態被打破后miRNA合成增多，可能是細胞死亡/損傷期間miRNA的被動釋放或是細胞主動分泌造成外周血中miRNA水平增高［15］。本研究將健康對照組、肝炎和肝纖維化人群的外周血進行RT-qPCR實驗分析后，發現肝纖維化患者miR-571水平顯著上升。實驗結果與RODERBURG等［12］對肝硬化患者血清進行微陣列篩選的結果一致。同時，我們將miR-571水平與ALT、AST、PLT、APRI評分和FIB-4指數進行相關性分析，ALT和AST是檢測肝功能最常用的生化指標，與肝細胞損傷的程度密切相關［16-17］。而APRI評分和FIB-4指數是在ALT、AST的基礎上結合了年齡和PLT等無創指標進行評估［18］。本研究發現miR-571水平與ALT、APRI評分和FIB-4指數呈正相關，與PLT呈負相關。

本研究還將miR-571與臨床常見指標結合，觀察多指標聯合診斷效能。通過logistic回歸分析找出FIB-4指數和miR-571是肝纖維化的獨立危險因素，并構建疾病診斷模型，ROC曲線結果顯示，FIB-4指數單獨診斷纖維化價值一般，而miR-571在截斷值為0.80時，其診斷纖維化的AUC為0.91（95%CI：0.85 ～ 0.96），敏感度和特異度分別為97.50%和77.50%，當FIB-4指數和miR-571聯合診斷肝纖維化截斷值為-1.75時，其診斷纖維化的AUC為0.942（95%CI：0.90 ～ 0.98），敏感度和特異度分別為95.00%和95.00%，因此兩者聯合使用對肝纖維化診斷具有較高的臨床意義。但本研究也存在不足之處：（1）本研究為小樣本研究，存在一定的局限性，未來在更大人群中進行證據級別更高的臨床研究來驗證我們的發現是很有必要的。（2）未進行患者的隨訪跟蹤，無法體現上述指標用于評估肝纖維化患者預后的臨床價值。

綜上所述，肝纖維化患者外周血miR-571的水平顯著上升，將miR-571和FIB-4指數聯合檢測在肝纖維化診斷中具有一定的臨床價值。但今后還需更大樣本量的臨床研究及相關實驗驗證造成外周血中miR-571表達升高的具體機制。