LC-MS/MS 法同時測定活血止痛膠囊/片中16 種真菌毒素及污染狀況分析

史 達，陳 潔，張 玲，胡紫艷，曹 玉*

（1.南京市食品藥品監督檢驗院，江蘇 南京 211198； 2.南京醫科大學藥學院，江蘇 南京 211112）

活血止痛膠囊/片均由三七、土鱉蟲等6 味藥材組成，具有活血散瘀、消腫止痛的功效［1］。真菌毒素是真菌產生的具有生物體內蓄積效應的有害次生代謝物，具有人體造血系統、免疫系統、生殖系統等毒性以及致癌和致畸作用［2-4］。據已有文獻研究，處方中三七與土鱉蟲均有玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素、伏馬毒素、雜色曲霉毒素等真菌毒素殘留現象［5-9］。同時，活血止痛膠囊及活血止痛片制備工藝均為全粉入藥，2020 年版《中國藥典》 通則“9305 中藥中真菌毒素測定指導原則” 規定，處方中含有易污染的藥材及生粉投料的中成藥品種應注意相關真菌毒素的測定。

2020 年版《中國藥典》 僅對處方中土鱉蟲規定黃曲霉毒素限度，活血止痛膠囊規定項下及活血止痛片劑執行標準［10］均未規定真菌毒素殘留限度。目前較為成熟的測定方法有液相色譜法［11］、酶聯免疫法［12］及液相色譜質譜聯用法［13-15］； 真菌毒素常用的前處理方法包括QuEChERS 凈化［13］、液液萃取［16］、固相萃取［17］、免疫親和凈化［18］等。本實驗通過對比QuEChERS 凈化、固相萃取凈化、免疫親和柱凈化這3 種前處理方法，建立高效液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS） 法準確、靈敏、快速篩查活血止痛膠囊和活血止痛片劑中16 種真菌毒素，以期為合理評價活血止痛制劑質量及為該類中成藥安全監管提供數據支撐與技術參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 液相色譜儀、Agilent 6470 三重四級桿質譜（美國Agilent 公司）； CPA225D 十萬分之一電子天平（德國Sartorius 公司）； Milli-Q 純水儀（美國Merck公司）； KQ-250B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率250 W，頻率30 kHz）； 渦旋混勻器 （德國Wiggens 公司）； N-EVAP24 型氮吹儀（美國Organomation公司）； Oasis Prime HLB 固相萃取柱、Oasis HLB 固相萃取柱（美國Waters 公司）。

1.2 試劑與藥物 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2對照品溶液（25 μg/mL），黃曲霉毒素M1、M2對照品溶液（10 μg/mL），伏馬毒素對照品溶液（50 μg/mL），HT-2 毒素對照品溶液（100 μg/mL），T-2 毒素對照品溶液（100 μg/mL），雜色曲霉毒素對照品溶液（50 μg/mL），脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對照品溶液 （100 μg/mL），赭曲霉毒素A 對照品溶液（10 μg/mL），玉米赤霉烯酮對照品溶液 （100 μg/mL），桔青霉毒素對照品溶液（100 μg/mL），真菌毒素六合一復合免疫親合柱（黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬毒素、T-2 毒素，6 mL），均購自青島普瑞邦生物工程有限公司。QuEChERS 試劑1（MgSO46 g、CH3COONa 1.5 g，貨號 5982-5755）、QuEChERS 試劑2 （PSA 800 mg、MgSO41 200 mg，貨號5982-6666）、QuEChERS 試劑3 （PSA 400 mg、MgSO41 200 mg，貨號5982-5058）、QuEChERS 試劑4 （Carbon S 90 mg、C18300 mg、PSA 300 mg、SiO2300 mg、MgSO4900 mg，貨號5610-2056）、QuEChERS 試劑5 （PSA 150 mg、C18EC 150 mg、MgSO41 200 mg，貨號5982-5156） 購自美國Agilent 公司。甲醇、乙腈為色譜純 （美國Honeywell 公司）； 甲酸、甲酸銨、乙酸銨為色譜純（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 水為超純水（實驗室自制）。活血止痛膠囊、活血止痛片均為市售，共40 批，來源于6 家生產企業，具體見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 LC-MS/MS 條件

2.1.1 色譜 Agilent RRHD Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）； 流動相水（含有0.1% 甲酸和2 mmol/L 甲酸銨，A） -乙腈 （B），梯度洗脫 （0 ～3 min，90%A； 3 ～8 min，90% ～60%A； 8 ～12 min，60% ～30% A；12～14 min，30% ～10% A； 14 ～15 min，10% A； 15 ～15.1 min，10% ～90% A； 15.1 ～18 min，90% A）； 體積流量0.3 mL/min； 柱溫35 ℃； 進樣量3 μL。

2.1.2 質譜 電噴霧離子源（ESI），正、負離子掃描； 離子源溫度350 ℃； 毛細管電壓3 500 V （＋）、2 500 V （-）；鞘氣體積流量12 L/min，溫度350 ℃； 霧化器壓力45 psi（1 psi＝6.895 kPa）； 采集模式，動態多反應離子監測模式（DMRM）。其他質譜參數見表2，MRM 色譜圖見圖1。

圖1 各真菌毒素MRM 色譜圖

表2 各真菌毒素質譜參數

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密吸取黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，黃曲霉毒素M1、M2，伏馬毒素B1、B2、B3，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，T-2 毒素，HT-2 毒素，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，桔青霉毒素，雜色曲霉毒素對照品溶液適量，置于20 mL 量瓶中，乙腈稀釋至刻度，制成含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，桔青霉毒素80 ng/mL，伏馬毒素B1、B2、B3，T-2 毒素800 ng/mL，玉米赤霉烯酮200 ng/mL，赭曲霉毒素A、雜色曲霉毒素160 ng/mL，HT-2 毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇2 000 ng/mL 的貯備液，密封，在-20 ℃下保存。精密吸取0.5 mL，置于10 mL 量瓶中，50%乙腈稀釋至刻度，逐級稀釋，即得（含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，桔青霉毒素0.1、0.2、0.4、1、2、4 ng/mL，伏馬毒素B1、B2、B3，T-2 毒素1、2、4、10、20、40 ng/mL，玉米赤霉烯酮0.25、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL，赭曲霉毒素A、雜色曲霉毒素0.2、0.4、0.8、2、4、8 ng/mL，HT-2 毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇2.5、5、10、25、50、100 ng/mL，編號S1～S6）。

2.2.2 供試品溶液

2.2.2.1 QuEChERS-HLB 凈化法 取本品約5 g，精密稱定，置于50 mL 離心管中，精密加入提取液（80% 乙腈-15%水-5%甲酸） 20 mL，渦旋振蕩2 min，加入QuEChERS提取試劑盒（含PSA 150 mg、C18150 mg、MgSO41 200 mg）渦旋振蕩5 min，10 000 r/min 離心5 min。精密量取上清液5 mL，加水稀釋至10 mL，搖勻，10 000 r/min 離心5 min，精密量取3 mL，緩慢通過已處理好的Oasis HLB 固相萃取柱（3 mL/150 mg，依次用甲醇、水各3 mL 洗脫） 直至有適量空氣通過，收集洗脫液，用3 mL 含0.2%甲酸的乙腈洗脫，收集合并洗脫液，40 ℃氮氣緩慢吹至近干，加入50%乙腈（含0.2%甲酸） 定容至1.5 mL，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.2.2 Prime HLB -IAC 凈化法 取本品約5 g，精密稱定，置于50 mL 離心管中，精密加入提取液（80% 乙腈-15%水-5%甲酸） 20 mL，渦旋振蕩2 min，10 000 r/min 離心5 min。精密量取上清液5 mL，緩慢通過Oasis Prime HLB固相萃取柱，1 mL 乙腈洗脫柱子，接凈化液加PBS 磷酸緩沖液配方（8.0 g NaCl、l.2 g Na2HPO4、0.2 g KH2PO4、0.2 g KCl，加990 mL 水溶解，鹽酸調節pH 值至7.0，再加水稀釋至1 000 mL） 稀釋至40 mL，稀釋液以重力自然速度通過免疫親合柱，20 mL 水洗脫，棄去洗脫液，使空氣進入柱子，將水擠出柱子后再用1.5 mL 乙腈（含0.2%甲酸）、0.5 mL 水依次洗脫（乙腈洗脫時稍作停留），收集洗脫液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.2.3 QuEChERS 凈化法 取本品約5 g，精密稱定，置于50 mL 離心管中，精密加入提取液（80% 乙腈-15% 水-5%甲酸） 20 mL，渦旋振蕩2 min，加入6 g MgSO4、1.5 g CH3COONa 渦旋振蕩2 min，10 000 r/min 離心5 min，精密吸取上清液10 mL，置于50 mL 離心管中，加入QuEChERS提取試劑（PSA 150 mg、C18150 mg、MgSO41 200 mg），渦旋5 min，10 000 r/min 離心5 min，取上清液5 mL，40 ℃氮氣緩慢吹至近干，50% 乙腈 （含0.2% 甲酸） 定容至1 mL，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.3 基質效應 取未檢出16 種真菌毒素的活血止痛膠囊（批號190328） 作為空白基質，按“2.2.2.1” 項下方法制備空白基質溶液，將“2.2.1” 項下貯備液分別用空白基質溶液、50%乙腈逐級稀釋，以各真菌毒素質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，分別以空白基質、50%乙腈制備標準曲線的斜率的比值對基質效應（ME） 進行評估［17，19］，以ME＞100%為基質增強效應，ME＜100%為基質抑制效應，ME 85% ～115% 為基質效應不明顯。結果，黃曲霉毒素B2、T-2 毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素均有明顯的基質抑制效應，而黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素M2、伏馬毒素B1、伏馬毒素B3、HT-2 毒素存在明顯基質增強效應，見圖2。

圖2 各真菌毒素基質抑制效應（A）、基質增強效應（B）

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 取“2.2.3” 項下基質空白溶液適量，按“2.2.1” 項下方法制備對照品溶液S1 ～S6，在“2.1” 項條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積響應值為縱坐標（Y） 進行回歸，并以S/N ＝10 時的質量濃度為定量限，S/N＝3 時的質量濃度作為檢測限，結果見表3，可知各真菌毒素在各自范圍內線性關系良好。

表3 各真菌毒素線性關系

2.3.2 精密度試驗 取“2.3.1” 項下對照品溶液S2，在“2.1 “項條件下進樣測定6 次，測得黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，伏馬毒素B1、B2、B3，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，T-2 毒素，HT-2 毒素，桔青霉毒素，雜色曲霉毒素峰面積RSD 分別為2.39%、2.68%、4.76%、2.70%、5.28%、3.84%、2.12%、5.87%、4.36%、7.91%、7.29%、5.77%、3.82%、3.77%、4.11%、3.48%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 精密稱取本品（批號190328） 5 g，按“2.2.2.1” 項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項條件下進樣測定，測得黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，伏馬毒素B1、B2、B3，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，T-2毒素，HT-2 毒素，桔青霉毒素，雜色曲霉毒素峰面積RSD分別為2.39%、1.67%、2.87%、2.93%、1.72%、1.41%、5.18%、9.32%、8.31%、11.06%、9.32%、9.05%、1.97%、3.58%、8.11%、6.13%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗 精密稱取本品（批號190328） 5 g，平行6 份，按“2.2.2.1” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項條件下進樣測定，測得黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，伏馬毒素B1、B2、B3，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，T-2 毒素，HT-2 毒素，桔青霉毒素，雜色曲霉毒素含量RSD 分別為1.78%、1.88%、3.11%、4.85%、3.89%、1.88%、6.20%、5.50%、10.76%、8.46%、6.39%、3.81%、1.22%、7.93%、3.91%、2.33%，表明方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取本品（批號190328）5 g，按低、中、高質量濃度水平分別精密加入對照品溶液50、125、500 μL，平行3 份，按“2.2.2.1” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項條件下進樣測定，計算回收率，結果見表4。

表4 各真菌毒素加樣回收試驗結果（n＝3）

2.4 樣品含量測定 取 40 批樣品，各 2 份，按“2.2.2.1” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項條件下進樣測定，以基質匹配標準曲線法測定含量。結果，檢出黃曲霉毒素B1、G1、伏馬毒素B1、B2、赭曲霉毒素A、雜色曲霉毒素，檢出率分別為20%、32.5%、57.5%、25%、42.5%、27.5%，其中黃曲霉毒素B1、G1檢出量分別為1.96～10.26、2.16～20.41 μg/kg，伏馬毒素B1、B2檢出量分別為22.45～812.2、12.52 ～913.8 μg/kg，赭曲霉毒素A檢出量為2.75 ～12.50 μg/kg，雜色曲霉毒素檢出量為2.99～32.78 μg/kg，表明真菌毒素殘留較嚴重，存在潛在用藥安全隱患。

3 討論

3.1 色譜條件、提取溶劑選擇 乙腈較甲醇洗脫能力強，柱效更高，甲酸銨較乙酸銨各真菌毒素響應更好，加入0.10%甲酸可明顯提高部分毒素離子化效率，故最終選擇乙腈-甲酸銨（2 mmol/L，0.10%甲酸） 作為流動相。甲醇雖比乙腈有更好的溶解性，但乙腈具有更好的選擇性，可有效避免過多提取脂肪、色素等雜質成分，并且一定比例水及甲酸可使部分水溶性、酸敏感性真菌毒素（伏馬毒素、赭曲霉毒素） 有更好響應，同時還可使樣品保持較高滲透性，故最終選擇80% 乙腈-15% 水-5% 甲酸系統作為提取溶劑。

3.2 凈化方式優化 活血止痛膠囊/片存在基質效應，同位素內標能夠最大程度減少基質效應的干擾，但其定制繁瑣，價格昂貴，而合適的提取凈化方式也能有效減少基質效應，本實驗參考文獻［13-14］，比較不同凈化方式選擇最優去除干擾物方式，發現僅以QuEChERS 提取凈化活血止痛基質，伏馬毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A 和HT-2 毒素回收率較差，但加入PSA、MgSO4試劑后有助于水相與有機相分層，而加入carbon S、SiO2等可導致黃曲霉毒素、伏馬毒素、雜色曲霉毒素、赭曲霉毒素A 等響應值偏低，并且過多PSA 也會影響伏馬毒素回收率，最終選擇PSA 150 mg、C18150 mg、MgSO41 200 mg 為提取試劑。進一步研究不同凈化方式組合，發現基質經過QuEChERS 提取并過Oasis HLB 固相萃取柱凈化或者直接通過Oasis Prime HLB 固相萃取柱與免疫親合柱串聯凈化可滿足目標真菌毒素回收率要求，但免疫親合柱中不含有雜色曲霉毒素、HT-2 毒素和桔青霉毒素等抗體導致該部分毒素回收率較差［20-24］。考慮到活血止痛膠囊/片中雜色曲霉毒素有較高的檢出率，因此本實驗為合理考察活血止痛膠囊/片中16 種真菌毒素殘留情況，最終選擇更經濟、適合高通量真菌毒素篩查的QuEChERS 提取組合Oasis HLB 固相萃取柱凈化作為提取凈化方式。

4 結論

本實驗采用LC-MS/MS 法，從40 批活血止痛膠囊/片中檢出黃曲霉毒素B1、G1，伏馬毒素B1、B2，赭曲霉毒素A，雜色曲霉毒素，提示該類中藥品種存在潛在的真菌毒素污染風險，患者口服用藥后有較大安全隱患，故應加強其來源藥材、加工、儲存等環節的監管。另外，該方法快速簡便，準確靈敏，可為合理評價活血止痛膠囊/片中真菌毒素殘留風險提供技術支撐，并為安全監管提供參考依據。