梔子金花湯對膿毒癥大鼠腸黏膜屏障及相關(guān)炎癥因子的影響

孫素靈，姜 逸，陸 雄，吳雪卿，楊孫虎，王 鳴*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院普外科，上海 200082； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實驗中心細胞生物與組織病理學(xué)實驗室，上海 201203； 3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203）

膿毒癥是一種由感染引起宿主強烈炎癥反應(yīng)并伴發(fā)器官功能障礙的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）［1］。盡管近年來膿毒癥治療有所進展，但它仍然是重癥監(jiān)護病房患者最常見的死亡原因之一［2-3］。一項全球性的膿毒癥發(fā)生率和死亡率回顧性研究結(jié)果顯示，僅在2017 年全球膿毒癥患者人數(shù)累計4 890 萬例，其中1 100 萬例患者報告死亡，占全球死亡人數(shù)的19.7%［4］。腸道是參與和加重膿毒癥的中心器官，被認為是全身炎癥反應(yīng)綜合征的“引擎”［5］。尤其在盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP） 模型中，腸屏障損傷導(dǎo)致腸道通透性增加，促使管腔微生物和內(nèi)毒素進入循環(huán)，誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)釋放進一步加劇多器官功能衰竭［6］。

梔子金花湯出自《醫(yī)宗金鑒·雜病心法要訣》［7］，在黃連解毒湯的基礎(chǔ)上添加一味大黃，對熱毒內(nèi)蘊患者有奇效。已有研究證實梔子金花湯可以通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)改善膿毒癥腹腔感染［8］，梔子金花湯保留灌腸在肛竇炎治療過程中亦可發(fā)揮良好的抑菌作用［9］。關(guān)于梔子金花湯對膿毒癥腸黏膜屏障的影響及機制探索不多，本研究旨在為相關(guān)臨床研究提供實驗室依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 SD 雄性大鼠30 只，8 周齡，體質(zhì)量（200±20） g，購自杭州醫(yī)學(xué)院［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （浙） 2019-0002］，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實驗動物中心，溫度（25±2）℃，相對濕度（60±10）%，光照日夜循環(huán)各12 h，自由飲食飲水，并按實驗動物使用的3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.2 藥物 生梔子、黃芩（批號20230421、2023030707，上海養(yǎng)和堂中藥飲片有限公司）； 黃連（批號220809，上海青浦中藥飲片有限公司）； 黃柏（批號230508，上海虹橋中藥飲片有限公司）； 大黃（批號20221117，上海萬仕誠藥業(yè)有限公司），藥材均購自上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房，經(jīng)專家鑒定為正品。梔子金花湯由梔子15 g、黃連15 g、黃芩10 g、黃柏10 g、大黃3 g 組成，藥材加蒸餾水1 L 浸泡30 min，武火燒開轉(zhuǎn)文火煎煮30 min，過濾，濾渣加蒸餾水1 L 復(fù)煎30 min，過濾，合并2 次濾液，加熱濃縮至生藥量3.6 g/mL。根據(jù)人與大鼠體表面積計算法換算，梔子金花湯低、中、高劑量組為6、18、36 g/kg，每天相當于臨床劑量的（1、3、6 倍）。

1.3 試劑 TNF-α、IL-10、IL-1β、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO） 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 檢測試劑盒（批號230714204R、230714229R、230714225R、230714245R，江蘇酶免實業(yè)有限公司）； 伊紅和蘇木素染液 （批號220602，上海虹橋樂翔醫(yī)用試劑技術(shù)有限公司）； 25%戊二醛水溶液、乙醇（批號20200109、20210728，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）； 鋨酸［批號10194309，阿法埃莎（中國） 化學(xué)有限公司］； 環(huán)氧樹脂E-51 （昆山綠循電子材料有限公司）； 異弗烷（批號20230403，青島歐博方醫(yī)藥科技有限公司）。

1.4 儀器 Axio imager 2 正置熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）； Tecnai G2 spirit 透射電子顯微鏡（美國FEI 公司）；Tianshi 988 洗板機（北京天石天力醫(yī)療器械技術(shù)開發(fā)中心）； Rayto RT-6100 酶標儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）； 電熱恒溫培養(yǎng)箱（武漢一恒蘇凈科學(xué)儀器有限公司）； TG16W 微量高速離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）； TGL16M 臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）； HT-111B 恒溫搖床（上海赫田科學(xué)儀器有限公司）； EasyWeLL 系列JY98-IIIN 細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 將大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和梔子金花湯高、中、低劑量組，每組6 只。參考文獻［10］ 報道，采用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP） 技術(shù)建立膿毒癥大鼠模型。大鼠吸入異氟烷麻醉，麻醉后固定于鼠板，繼續(xù)予以異氟烷維持。大鼠腹部剃毛備皮，用75% 乙醇消毒，用手術(shù)剪刀從大鼠腹部正中開口（倒T 型） 暴露腹腔，將盲腸輕輕拉出并分離腸系膜，在距盲腸末端1 cm 處用3-0號無菌手術(shù)縫線結(jié)扎，然后用22G 針頭在盲腸結(jié)扎遠端中央?yún)^(qū)域貫通穿刺2 次（注意避開血管），輕微擠壓盲腸，確保穿刺點通暢，隨后將腸段送回腹腔，用6-0 號無菌手術(shù)縫線關(guān)閉腹膜及腹肌，最后縫合皮膚； 假手術(shù)組除不進行盲腸結(jié)扎與穿孔外，其余手術(shù)操作同模型組。手術(shù)結(jié)束后，大鼠于鼠籠內(nèi)觀察1 h 后放回動物飼養(yǎng)中心繼續(xù)飼養(yǎng)。其中模型組死亡2 只。造模后次日，梔子金花湯高、中、低劑量組灌胃給予6、18、36 g/kg 藥液，假手術(shù)組和模型組灌胃給予生理鹽水，每天2 次，每次間隔12 h，連續(xù)給藥3 d［11］。

2.2 膿毒癥模型評判 給藥結(jié)束后，參考文獻［12］ 報道，從外觀、自主意識、自主活動、對刺激的反應(yīng)、眼睛是否有分泌物、呼吸頻率、呼吸質(zhì)量7 個指標進行評價，每個指標分成5 個等級（0～4 分），總分為7 個指標的分數(shù)相加，最高分為28 分，若大鼠出現(xiàn)死亡則記為最高分。評分標準見表1。

表1 膿毒癥模型評分標準

2.3 HE 染色觀察回腸組織病理變化 末次給藥后禁食不禁水12 h，次日采用異氟烷麻醉大鼠后，取血5 mL，并取回腸部位。取部分回腸于10%中性甲醛中固定，乙醇梯度脫水后進行石蠟包埋，切片，依次使用二甲苯、乙醇脫蠟，蘇木素染核，鹽酸乙醇分化，伊紅染胞漿，自然晾干后樹脂封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察回腸組織病理結(jié)構(gòu)變化。

2.4 透射電鏡觀察回腸組織超微結(jié)構(gòu) 取部分回腸段固定于2.5%戊二醛中，0.1 mol/L PBS 充分浸洗3 次后，依次使用1%鋨酸后固定，梯度乙醇、丙酮脫水，采用環(huán)氧樹脂618 浸透固化，超薄切片70 nm，使用醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染色，蒸餾水洗3 次，自然晾干后于透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。

2.5 ELISA 法檢測血清及回腸組織DAO、TNF-α、IL-1β、IL-10 水平 血液樣本室溫放置2 h，3 500 r/min 離心10 min，取上層血清，備用； 取適量回腸組織，加入0.1 mol/L PBS 破碎勻漿，離心取上清，蛋白定量后備用。按照相應(yīng)試劑盒說明書檢測血清及回腸組織DAO、TNF-α、IL-1β、IL-10 水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 通過GraphPad Prism 9.0.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 梔子金花湯對膿毒癥大鼠膿毒癥評分的影響 如圖1所示，與假手術(shù)組比較，模型組膿毒癥評分升高 （P＜0.01），平均26 分，提示造模成功； 與模型組比較，梔子金花湯中、高劑量組膿毒癥評分降低（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠膿毒癥評分（±s，n＝4～6）

3.2 梔子金花湯對膿毒癥大鼠回腸組織病理形態(tài)的影響如圖2 所示，假手術(shù)組大鼠回腸各層結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛排列整齊，未見炎癥細胞浸潤； 模型組大鼠回腸結(jié)構(gòu)破壞嚴重，腸絨毛排列紊亂，部分腸上皮層脫落，黏膜層可見大量炎性細胞聚集，以中性粒細胞為主； 與模型組比較，梔子金花湯各劑量組回腸結(jié)構(gòu)基本完整，少量腸上皮細胞脫落，低劑量組黏膜層炎性細胞浸潤面積減少，中、高劑量組炎性細胞數(shù)量偶見且優(yōu)于低劑量組。

圖2 各組大鼠回腸組織HE 染色（×200）

3.3 梔子金花湯對膿毒癥大鼠回腸組織黏膜屏障超微結(jié)構(gòu)的影響 如圖3 所示，假手術(shù)組大鼠腸黏膜上皮細胞結(jié)構(gòu)完整、邊界清晰，細胞器、連接結(jié)構(gòu)正常； 與正常組比較，模型組大鼠腸上皮細胞結(jié)構(gòu)破壞嚴重，表現(xiàn)為微絨毛大量脫落，連接結(jié)構(gòu)疏松不明，細胞膜破碎； 與模型組比較，梔子金花湯低劑量組無明顯變化，中、高劑量組大鼠腸上皮細胞結(jié)構(gòu)相對完整。

圖3 各組大鼠回腸組織超微結(jié)構(gòu)（×8 200）

3.4 梔子金花湯對膿毒癥大鼠血清和回腸組織DAO 及炎癥因子水平的影響 如圖4 ～5 所示，與正常組比較，模型組大鼠血清和回腸組織DAO 水平升高（P＜0.01），提示腸黏膜細胞受損，回腸機械性屏障完整性破壞； 促炎因子TNF-α、IL-1β 水平升高（P＜0.01），而血清抗炎因子IL-10水平降低（P＜0.05），回腸組織IL-10 水平無明顯變化（P＞0.05）。與模型組比較，梔子金花湯中、高劑量組血清IL-1β 水平及血清和回腸組織DAO、TNF-α 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），血清和回腸組織IL-10 水平升高 （P＜0.05，P＜0.01）； 低劑量組血清DAO、IL-1β 水平降低（P＜0.01），血清IL-10 水平升高（P＜0.01）； 中劑量組回腸組織IL-1β 水平降低（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠血清DAO、TNF-α、IL-1β、IL-10 水平（±s，n＝4～6）

圖5 各組大鼠回腸組織DAO、TNF-α、IL-1β、IL-10 水平（±s，n＝4～6）

4 討論

膿毒癥病情兇險，是重癥監(jiān)護病房患者常見死亡原因［3］。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展膿毒癥主流的抗感染治療和器官功能支持技術(shù)獲得了長足進步，但膿毒癥的ICU 監(jiān)測和治療花費頗多，嚴重消耗公共醫(yī)療資源。疾病預(yù)后差，又拖累患者的后期生活質(zhì)量。從個人家庭和社會層面，膿毒癥都造成了巨大威脅。如何拓展膿毒癥的治療手段，降低膿毒癥的重癥死亡率，是各類臨床或?qū)嶒炇已芯克媾R的嚴苛挑戰(zhàn)。膿毒癥機制復(fù)雜尚未闡明，在CLP 模型中盲腸創(chuàng)傷誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)過度激活，炎癥介質(zhì)的觸發(fā)、增強和放大效應(yīng)是病理核心［13］。

中醫(yī)經(jīng)典中并無“膿毒癥” 對應(yīng)病名，諸醫(yī)家普遍將其歸入“傷寒” “溫病” “疫病” 范疇，可參見“異病同治” 或“同病異治” 理論予以治療。《醫(yī)宗金鑒》 記載梔子金花湯主治痘中厥逆，因陽毒內(nèi)攻，熱極反寒，致熱厥者，與膿毒癥早期“毒熱證機理相合”。梔子金花湯方組黃芩、黃連、黃柏、梔子、大黃，在黃連解毒湯基礎(chǔ)上添加一味大黃形成。黃連解毒湯主治三焦火毒，且多項研究證實黃連解毒湯對膿毒癥早期之毒熱證有較好抗炎療效，在中醫(yī)臨床應(yīng)用于各類感染性疾病和胃腸道疾病等［14-15］。此外大黃性味苦、寒，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒的功效。現(xiàn)代藥理研究證實大黃主要有效成分大黃素可以通過TLR4 信號通路減輕LPS 誘導(dǎo)的腸上皮細胞損傷，并上調(diào)縫隙接連蛋白CX43 表達［16］。本實驗結(jié)果表明，梔子金花湯中、高劑量組可明顯改善CLP 模型大鼠回腸黏膜層炎癥細胞浸潤，減少中性粒細胞積聚，降低血清和局部回腸組織相關(guān)促炎因子TNF-α、IL-1β 水平，升高抗炎因子IL-10 水平，提示梔子金花湯對膿毒癥大鼠具有較好的抗炎作用。

腸道作為膿毒癥多器官功能障礙綜合征關(guān)鍵一環(huán)，也是非腸源性膿毒癥的靶目標，近乎半數(shù)的膿毒癥患者伴嚴重腸道功能障礙［17］。而腸上皮細胞作為腸道重要的生理屏障，一旦腸上皮完整性喪失，細菌和內(nèi)毒素移位入血，由此誘導(dǎo)一系列級聯(lián)反應(yīng)造成多器官衰竭。DAO 是一種分布在人類和哺乳動物小腸黏膜上層絨毛中的高度活性的細胞內(nèi)酶，在組胺和多種多胺代謝中起作用，其活性與黏膜細胞的核酸和蛋白合成密切相關(guān)，能夠反映腸道機械屏障的完整性和受損傷程度［18］。本實驗結(jié)果表明，梔子金花湯中、高劑量組腸絨毛排列相對整齊，結(jié)構(gòu)相對完整； 腸上皮超微結(jié)構(gòu)損傷有所改善，腸上皮細胞結(jié)構(gòu)相對完整，微絨毛脫落減少，連接結(jié)構(gòu)相對緊密； 血清和回腸組織DAO水平減少。

綜上所述，梔子金花湯可以改善CLP 致膿毒癥大鼠模型血清和回腸組織炎癥反應(yīng)，通過保護腸上皮細胞及其連接結(jié)構(gòu)維護腸屏障的完整性。本研究為后續(xù)梔子金花湯減輕炎癥、保護腸屏障來改善膿毒癥的深入機制研究提供前期基礎(chǔ)。