基于量值傳遞的仁術健胃顆粒工藝過程研究

貴書琪，鄭艷萍，成 俊，，趙開軍，彭 雲，黃 芳

（1.南京中山制藥有限公司，江蘇省中藥經典名方工程技術研究中心，江蘇 南京 210046； 2.中國藥科大學中藥學院，江蘇 南京 211198； 3.江蘇弘典中藥產業研究院有限公司，南京市工程技術研究中心，江蘇 南京 210042）

脾胃病科學術帶頭人單兆偉教授四十余年來通過系列臨床及基礎研究總結提出慢性萎縮性胃炎胃黏膜癌前期病變的主要病機特點是“氣虛血瘀熱郁”，制定“益氣活血清熱” 為主要治療法則，開發仁術健胃顆粒［1］。該方由炙黃芪、酒黃芩、薏苡仁、莪術、麩炒白術、白花蛇舌草、半邊蓮、仙鶴草組成。大量文獻研究表明，仁術健胃顆粒治療慢性萎縮性胃炎胃黏膜癌前病變具有良好的療效，該藥作為江蘇省中醫院院內制劑已有二十余年的應用基礎［2-4］。

前期該藥已轉讓南京中山制藥有限公司，為了更加全面保留藥效成分，提高臨床藥效，經進一步制劑研究，增加了醇提、超微粉碎［5-7］、揮發油提取包合［8］、噴霧制粒［9］等先進工藝制劑技術。與此同時還開展了Ⅱ期臨床試驗和Ⅲ期臨床驗證，證實其對慢性萎縮性胃炎胃黏膜癌前病變具有良好的臨床療效。目前，對仁術健胃顆粒質量和工藝相關的研究很少，相關的成分定量分析只有黃芪甲苷的報道［10］，無量值傳遞方面的文章。本研究通過對生產過程中各個關鍵環節取樣，成分分析，研究飲片-中間體-成品藥效成分的轉移過程，并與原工藝生產顆粒（江蘇省中醫院院內制劑仁術健胃顆粒） 進行比較，以期為仁術健胃顆粒后續開發研究和相關制劑的質量控制提供依據。

1 材料

1.1 儀器 仁術健胃顆粒生產設備為南京中山制藥有限公司中試顆粒劑生產線，已通過《藥品生產質量管理規范》（GMP） 認證，證書編號JS20191043。高效液相色譜系統，包括LC-20AT 泵、ELSD-16 蒸發光散射檢測器、LC-40D泵、SPD-M40 二極管陣列檢測器、Labsolutions 工作站等（日本島津公司）； KH-500E 超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）； PL602-L、ML104/02、XSR105DU/A、XPR2/A 電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）； DK-98-ⅡA 電熱恒溫水浴鍋 （天津市泰斯特儀器有限公司）；FLBP-250 萬能高速粉碎機（上海菲力博食品機械有限公司）； RODI-220A1 純水機（廈門銳思捷水純化技術有限公司）； BT-9300H 激光粒度分布儀 （丹東百特儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 黃芪甲苷（批號110715-202118，純度96.8%）、黃芩苷（批號110715-202122，純度94.2%）、甘油三油酸酯（批號111692-202007，純度99.6%）、吉馬酮（批號111665-201906，純度99.8%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。仁術健胃顆粒（蘇藥制藥Z04001773，批號2103004、2108014、2109017）。甲醇、磷酸、乙腈、二氯甲烷為色譜純； 其他試劑均為分析純； 水為純化水。

炙黃芪（批號200801）、酒黃芩（批號200902） 均購自安徽亳藥千草國藥股份有限公司； 薏苡仁 （批號200901）、白花蛇舌草（批號200801） 均購自國藥集團北京華邈藥業有限公司； 莪術（批號200801） 購自廣西三豐現代農業有限公司； 麩炒白術（批號200904） 購自安徽亳藥千草中藥飲片有限公司； 半邊蓮（批號201001）、仙鶴草（批號201001） 均購自安徽金國源中藥股份有限公司，經南京中山制藥有限公司質量部專家檢測均符合2020 年版《中國藥典》 規定，南京中山制藥有限公司趙開軍執業藥師鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 生產工藝驗證研究

2.1.1 生產工藝 在仁術健胃顆粒（批件號2003L04442）處方量基礎上，放大投料，連續生產3 批。處方中，薏苡仁、白術粉碎成超微粉； 莪術水蒸氣蒸餾法提取揮發油，β-環糊精包合，得到藥渣Ⅰ及水溶液另置，備用； 炙黃芪、半邊蓮、白花蛇舌草用乙醇回流提取，提取液過濾，回收乙醇，濾液濃縮至適量，得到清膏Ⅰ和藥渣Ⅱ； 藥渣Ⅱ、藥渣Ⅰ與酒黃芩、仙鶴草加水煎煮，與莪術油提取后的水溶液過濾，濃縮，得到清膏Ⅱ； 清膏Ⅰ與清膏Ⅱ合并，濃縮成清膏Ⅲ； 取清膏Ⅲ，加入薏苡仁和白術超微粉、莪術油β-環糊精包合物，得中間體； 中間體與適量糊精、甜菊糖苷混合，制成顆粒，干燥，整粒，包裝，即得。

2.1.2 生產結果 根據“2.1.1” 項下生產工藝流程進行生產，得到生產數據，計算清膏密度（密度計測定）、清膏得率、干膏率、超微粉粒徑（激光粒度分布儀測定）、超微粉出率、包合物出率、成品率，公式為清膏得率＝（清膏Ⅲ數量/飲片投料量） ×100%、干膏率＝ （干膏質量取樣/濕膏質量取樣） ×100%、超微粉出率＝ （白術薏苡仁混合超微粉質量/白術薏苡仁飲片總質量） ×100%、包合物出率＝ ［揮發油包合物量/ （莪術揮發油量＋β-環糊精量） ］ ×100%、成品率＝ ［成品數量/理論產量（即固體輔料總量＋清膏Ⅲ折合干膏量） ］ ×100%，中間體批號分別為2102、2103、2104，顆粒相應批號分別為210701、210702、210703，結果見表1，可知從提取、打粉、包合到制粒整個過程生產數據相對穩定。

表1 生產數據結果

2.2 指標成分檢測方法建立

2.2.1 色譜條件

2.2.1.1 條件1 （黃芪甲苷） Waters Symmetry ?色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相甲醇-水（76 ∶24）； 體積流量1.0 mL/min； 蒸發光散射檢測器； 漂移管溫度82 ℃； 載氣流量1.95 L/min； 柱溫30 ℃； 進樣量20 μL。分離度大于1.5，理論塔板數按黃芪甲苷峰計，不低于5 000。

2.2.1.2 條件2 （黃芩苷） YMC-Pack ODS-A 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相甲醇-水-磷酸 （47 ∶53 ∶0.2）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫35 ℃； 進樣量10 μL； 檢測波長280 nm。分離度大于3.0，理論塔板數按黃芩苷峰計，不低于8 000。

2.2.1.3 條件3 （甘油三油酸酯） YMC-Pack ODS-A 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈-二氯甲烷（65 ∶35）； 體積流量1.0 mL/min； 蒸發光散射檢測器； 漂移管溫度82 ℃； 載氣流量1.95 L/min； 柱溫30 ℃； 進樣量10 μL。分離度大于5.0，理論塔板數按甘油三油酸酯峰計，不低于30 000。

2.2.1.4 條件4 （吉馬酮） YMC-Pack ODS-A 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈（A） -0.1% 磷酸水（B），梯度洗脫 （0 ～15 min，55% A； 15 ～40 min，55% ～70% A； 40 ～42 min，70% ～85% A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫25 ℃； 進樣量10 μL； 檢測波長215 nm。分離度大于6.0，理論塔板數按吉馬酮峰計，不低于60 000。

2.2.2 對照品溶液制備 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定質量，加甲醇制成每1 mL 含0.4、0.2 mg 的對照品溶液。取黃芩苷對照品適量，60 ℃下減壓干燥4 h，精密稱定質量，加70%乙醇制成每1 mL 含20、60 μg 的對照品溶液。取甘油三油酸酯對照品適量，精密稱定，加乙腈-正丁醇（65 ∶35） 制成每1 mL 含50、150 μg 的對照品溶液。取吉馬酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含10、40 μg 的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備

2.2.3.1 黃芪甲苷 取仁術健胃顆粒約4 g，研細，平行2份，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇35 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收甲醇并濃縮至干，殘渣加水10 mL，微熱使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，氨液提取2次，每次20 mL，棄去氨液，將正丁醇液蒸干，殘渣加水3～5 mL 溶解，放冷，通過D101 大孔吸附樹脂柱（內徑1.5 cm，長12 cm），以50 mL 水洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL 洗脫，棄去40%乙醇洗脫液，再用70%乙醇50 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，甲醇溶解并轉移至2 mL 量瓶內，加甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。精密稱取第1 次醇提液、第2 次醇提液、清膏Ⅰ、清膏Ⅲ適量，平行2 份，回收溶劑并濃縮至干，其余步驟同上，得相應中間體的供試品溶液。取炙黃芪飲片適量，按照2020 年版《中國藥典》 炙黃芪黃芪甲苷含量測定項下方法制備。

2.2.3.2 黃芩苷 取仁術健胃顆粒約1 g，研細，平行2份，精密稱定，加70% 乙醇40 mL，加熱回流3 h，放冷，過濾，濾液置于100 mL 量瓶中，用少量70%乙醇分次洗滌容器和殘渣，洗液濾入同一量瓶中，加70% 乙醇至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置10 mL 量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。精密稱取第1 次水提液、第2 次水提液、清膏Ⅱ、清膏Ⅲ適量，平行2 份，分別加入適量70%乙醇超聲處理20 min，放冷，過濾，濾液置于100 mL 量瓶中，用少量70%乙醇分次洗滌容器和殘渣，洗液濾入同一量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻（其中清膏Ⅲ在此基礎上稀釋10 倍后進樣），0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。取酒黃芩飲片中粉約0.3 g，平行2 份，精密稱定，其余步驟同上，即得。

2.2.3.3 甘油三油酸酯 取仁術健胃顆粒約4 g，研細，平行2 份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙腈-正丁醇（65 ∶35） 50 mL，稱定質量，浸泡2 h，超聲處理1 h，放冷，流動相補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液過0.22 μm 微孔濾膜，即得。精密稱取白術薏苡仁混合超微粉和飲片粉末適量，平行2 份，其余步驟同上，即得。

2.2.3.4 吉馬酮 取仁術健胃顆粒約1 g，研細，平行2份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定質量，超聲提取45 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液過0.22 μm 微孔濾膜，即得。精密稱取莪術揮發油、揮發油包合物及飲片粉末適量，平行2份，其余步驟同上，即得，其中揮發油續濾液稀釋50 倍后進樣。

2.2.4 陰性樣品溶液制備 按照仁術健胃顆粒工藝，分別制備缺炙黃芪、缺酒黃芩、缺薏苡仁、缺莪術陰性顆粒的陰性樣品，再按“2.2.3” 項下方法處理，即得。

2.2.5 專屬性考察 精密吸取對照品、供試品（210701）、陰性樣品溶液適量，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1，可知供試品溶液中各成分色譜峰分離度理想，陰性樣品溶液在相應位置處未見色譜峰，表明該方法專屬性良好。

2.2.6 線性關系考察 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，甲醇制成1.461 7 mg/mL 對照品溶液，依次稀釋至1.169 3、0.974 5、0.779 6、0.584 7、0.389 8、0.194 9、0.097 4、0.048 7 mg/mL，在“2.2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以進樣量自然對數值為橫坐標（X），峰面積自然對數值［11］為縱坐標（Y） 進行回歸。

精密稱取黃芩苷對照品適量，70%乙醇制成152.886 6 μg/mL 對照品溶液，依次稀釋至129.953 6、76.443 3、57.332 5、38.221 7、19.110 8、9.555 4、4.777 7 μg/mL，在“2.2.1.2” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸。

精密稱取甘油三油酸酯對照品適量，乙腈-正丁醇（65 ∶35） 制成220.713 6 μg/mL 對照品溶液，依次稀釋至154.499 5、108.149 7、75.704 8、52.993 4、31.796 0、19.077 6 μg/mL，在“2.2.1.3” 項色譜條件下進樣測定。以進樣量自然對數值為橫坐標（X），峰面積自然對數值為縱坐標（Y） 進行回歸。

精密稱取吉馬酮對照品適量，甲醇制成80.838 0 μg/mL對照品溶液，依次稀釋至40.419 0、10.104 8、5.052 4、2.021 0、1.010 5、0.505 2 μg/mL，在“2.2.1.4” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸。結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系

2.2.7 精密度試驗 精密吸取同一份供試品溶液（210701），在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得黃芪甲苷、黃芩苷、甘油三油酸酯、吉馬酮峰面積RSD 分別為2.58%、0.21%、1.72%、0.55%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗 取同一份供試品溶液（210701），于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得黃芪甲苷、黃芩苷、甘油三油酸酯、吉馬酮峰面積RSD 分別為2.99%、0.35%、1.55%、1.09%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.2.9 重復性試驗 取仁術健胃顆粒（210701） 適量，按“2.2.2” 項下方法平行制備供試品溶液6 份，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得黃芪甲苷、黃芩苷、甘油三油酸酯、吉馬酮含量RSD 分別為2.60%、0.66%、2.74%、1.44%，表明該方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的仁術健胃顆粒（210701） 適量，按80%、100%、120% 水平加入對照品，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，平行3 份，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，黃芪甲苷、黃芩苷、甘油三油酸酯、吉馬酮平均加樣回收率分別為88.18%、100.39%、94.12%、101.30%，RSD 分別為2.03%、1.56%、2.76%、1.93%。

2.3 檢測分析結果 按“2.1” 項下生產工藝制備3 批仁術健胃顆粒生產過程各環節取樣樣品，按“2.2” 項下方法進行相應成分分析，圖2 ～5 為飲片、不同中間體以及江蘇省中醫院（簡稱“省中” ） 生產的仁術健胃顆粒色譜圖，南京中山制藥有限公司（簡稱“中山” ） 仁術健胃顆粒和陰性樣品色譜圖見圖1，表3 中山和省中成品顆粒含量比較結果及其計算所得服用量。由表3 可知，中山與省中仁術健胃顆粒對比，每次服用相同生藥量（中山本品每次服用量12 g 相當于省中本品每次服用量20 g） 的情況下，黃芩苷每次服用量相近； 黃芪甲苷每次服用量中山為3.05 ～4.01 mg，省中為0.75～1.66 mg，差異較大； 在中山仁術健胃顆粒中檢測出甘油三油酸酯和吉馬酮，而在省中仁術健胃顆粒中則未檢測到。

圖2 黃芪甲苷HPLC 色譜圖

圖3 黃芩苷HPLC 色譜圖

圖4 甘油三油酸酯HPLC 色譜圖

圖5 吉馬酮HPLC 色譜圖

表3 不同批次顆粒含量比較及其每次服用量

2.4 生產過程控制研究

2.4.1 轉移率 炙黃芪飲片3 批投料量均為19.2 kg，白術、薏苡仁飲片用量比例1 ∶1，分別為白術、薏苡仁混合超微粉實際投料量/各批次超微粉出率×1/2，其他飲片3批投料量均為14.4 kg，計算成分總量、轉移率，公式為成分總量＝平均含量×投料量或產出量、轉移率＝ （當前環節成分總量/轉移環節成分總量） ×100%，結果見表4。

表4 轉移率測定結果

2.4.2 結果分析 由表4 數據得到各指標成分轉移率的變化趨勢，見圖6。仁術健胃顆粒生產過程中提取濃縮、打粉、包合、制粒各個環節轉移率均相對穩定； 從清膏Ⅰ與清膏Ⅱ混合后濃縮到清膏Ⅲ黃芪甲苷轉移率穩定，RSD 僅為0.61%，而此過程批號2102 黃芩苷轉移率僅為61.84%，其余批次均在77%以上，RSD 達13.34%； 從清膏Ⅲ到仁術健胃顆粒黃芩苷轉移率較平行，而該過程黃芪甲苷轉移率分別為71.89%、95.12%、85.01%； 制粒過程中甘油三油酸酯轉移率僅為45% ～55%； 莪術油提取階段吉馬酮的轉移率均小于50%。

圖6 黃芪甲苷（A）、黃芩苷（B）、甘油三油酸酯（C）、吉馬酮（D） 轉移率變化

3 討論

3.1 指標成分選擇 就處方配伍組成而言，君藥黃芪益胃氣健脾； 黃芩清胃中濕熱； 薏苡仁消瘤抗癌； 莪術化瘀軟堅。以上諸藥配伍，共奏補氣、活血、改善微循環之功，增強胃粘膜免疫力，阻斷胃癌前病變的發展，促進腸化、異型增生的康復［12］。另外，黃芪、黃芩、薏苡仁、莪術分別代表醇提、水提、超微粉碎、揮發油包合4 個關鍵控制點。就成分選擇而言，4 種成分在相應陰性樣品中無干擾，較穩定，且黃芪甲苷、黃芩苷、甘油三油酸酯為2020 年版《中國藥典》 中規定的對應飲片含量測定成分［13］。研究表明黃芪甲苷是黃芪發揮益氣功效的主要物質［14］； 黃芩苷具有抑菌抗炎、解熱的功效［15］； 薏苡仁油中甘油三油酸酯具有抗腫瘤作用［16］； 吉馬酮具有改善血液流變性、抗血小板聚集等作用［17］。另外，4 種成分均能改善慢性萎縮性胃炎模型大鼠的胃黏膜病理病變，抑制胃癌細胞增殖并誘導其凋亡［18-23］。綜上所述，本研究選取的指標成分可能為仁術健胃顆粒發揮藥效的物質，并且能夠較為全面反映各個環節藥效成分的量值傳遞情況。

3.2 含量測定 本研究中4 種指標成分極性差異較大，故供試品溶液制備過程及色譜條件等不一。對提取溶劑、提取時間進行了考察，對洗脫條件、載氣流量等條件進行了篩選，提高了檢測成分的分離度及方法的準確度［24］。

本研究中，黃芪甲苷的回收率相對較低，主要是由于仁術健胃顆粒成分復雜，不適用2020 年版《中國藥典》 黃芪中測定黃芪甲苷的前處理方法。本研究方法供試品前處理步驟繁瑣，影響因素較多，處理過程中各個環節誤差疊加，導致回收率偏低。2020 年版《中國藥典》 規定，樣品中待測定成分含量在100 μg/g、1 mg/g、10 mg/g 時，加樣回收率限度分別為85% ～110%、90% ～108%、92% ～105%，結合表3 可知本研究結果滿足4 種成分的檢測需求。

3.3 轉移率 黃芪甲苷和黃芩苷提取過程轉移率均達到80%以上，而從總醇（水） 提液到清膏Ⅰ（Ⅱ） 的黃芪甲苷和黃芩苷轉移率均有所下降； 清膏Ⅰ與清膏Ⅱ混合濃縮到清膏Ⅲ過程中，批號2102 清膏Ⅲ黃芩苷的轉移率相比其余批次差異較大。導致上述結果的可能原因一方面是濃縮時溫度和壓力控制不當，皂苷類成分如黃芪甲苷容易起泡，一部分成分隨著溶劑進入回收溶劑罐內。另一方面，在將濃縮液放出取樣稱重時，濃縮罐內難免會殘留一部分清膏。因此濃縮作為一個關鍵控制點，應該嚴格把控。

另外，從清膏Ⅰ與清膏Ⅱ混合后濃縮到清膏Ⅲ黃芪甲苷轉移率約為94%，相對于該步驟黃芩苷轉移率（61.84% ～79.62%） 明顯偏高，其原因可能為醇提后藥渣Ⅱ仍含有一部分的黃芪甲苷而后繼續水提最終轉移至清膏Ⅲ中。

甘油三油酸酯在超微粉碎過程轉移率達88%以上，影響的主要因素是超微粉出率。吉馬酮在莪術油包合過程中轉移率也不低，這也進一步說明超微粉碎及揮發油包合這2種先進的工藝技術能夠充分保留藥效成分。影響甘油三油酸酯總轉移率的關鍵步驟是制粒過程，而莪術油的提取過程是限制吉馬酮量值傳遞的首要因素。

制粒時藥液的黏度與流量、進出風口的溫度等控制不當會發生粘壁現象，底料中的白術薏苡仁超微粉和莪術油包合物以及藥液中的清膏Ⅲ中成分的損耗是導致這一環節三批轉移率偏低和不太穩定的主要原因，應引起重視。

3.4 與省中院內制劑比較 結果表明，在服用中山和省中顆粒時每次服用黃芩苷量相近，而黃芪甲苷差異較大，主要原因是省中在該制劑工藝中所有藥材均使用水提取，而中山根據藥材成分性質，對酒黃芩使用水提，對炙黃芪使用醇提，提取更為完全。超微粉碎及莪術油的提取保留了一些不溶于水的極性比較小的成分如甘油三油酸酯和吉馬酮，所以在省中本品中檢測不到兩者。另外，中山工藝中對醇提后的藥渣和莪術藥渣還進一步用水提取，工藝精細巧妙而又不失科學。

4 結論

本研究對仁術健胃顆粒采用量值傳遞規律的方法進行研究，此種質量控制模式依托各生產環節的銜接，每個環節設有“輸入質量” 與“輸出質量”［25］，加以科學合理的指標進行評估，強調了中藥復方研究過程的整體性和全程可追溯性。從與省中仁術健胃顆粒院內制劑比較得出，中山在其基礎上對工藝進行了深入研究，更大程度上保留了藥效成分，提高了臨床療效，是中藥現代化制劑研究的典范，對傳統復方中成藥二次開發具有指導作用。