神經(jīng)酸口服給藥后在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

黃和飛，陽 劍，李 霽，徐湘婷，李孟蓮，李 波，呂小波*，張 玲*

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500； 2.昆明和合醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，云南 昆明 650106）

蒜頭果MalaniaoleiferaChunet S.Lee 為鐵青樹科蒜頭果屬植物，是我國(guó)特有、云南省特色植物，其果實(shí)所含的神經(jīng)酸含量高達(dá)60% 以上，是目前該成分含量最高的植物［1-5］。神經(jīng)酸是一種長(zhǎng)鏈單不飽和omega-9 脂肪酸，最早在哺乳動(dòng)物神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)［3-8］，為大腦、神經(jīng)發(fā)育及其正常功能維持所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在體內(nèi)合成極少，主要靠體外攝取補(bǔ)充［7］，具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖和分化、延緩大腦老化、增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力、調(diào)節(jié)血脂血糖、提高免疫等功能，也是大腦神經(jīng)組織和神經(jīng)細(xì)胞的核心成分［1-10］，同時(shí)抑郁、注意力缺陷障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾病也與體內(nèi)該成分含量相關(guān)［6，11-12］，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究?jī)r(jià)值很高。目前，對(duì)植物型神經(jīng)酸的研究尚處于起步階段，主要涉及其藥理活性、提取、分離、制備等方面，尚未涉及藥動(dòng)學(xué)，故本實(shí)驗(yàn)建立LC-MS/MS 法考察神經(jīng)酸口服給藥后在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)，以期為后續(xù)相關(guān)藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 8050CL 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本島津公司）； 醫(yī)用高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）； MD200-2 氮吹儀 （杭州奧盛儀器有限公司）；XA105 電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；多管渦旋振蕩器（杭州米歐儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 神經(jīng)酸對(duì)照品（純度≥95%，白色片狀結(jié)晶） 由云南醫(yī)科萬正生物科技股份有限公司提供； 神經(jīng)酸對(duì)照品（純度≥99%） 購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司。甲醇（色譜純）、乙酸乙酯（分析純） （德國(guó)Merck 公司）； 水為蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.3 動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180 ～220 g，來源于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （滇） K2020-0004。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液 精密稱取神經(jīng)酸對(duì)照品5 mg，轉(zhuǎn)移到10 mL量瓶中，加入8 mL 甲醇，超聲溶解10 min 后定容至刻度，即得（質(zhì)量濃度為500 μg/mL），取適量，流動(dòng)相逐步稀釋至0.625、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μg/mL。

2.1.2 含藥血漿對(duì)照品溶液 取“2.1.1” 項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)工作液各100 μL，加到900 μL 大鼠空白血漿中，即得（外源性神經(jīng)酸質(zhì)量濃度分別為0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL，血漿隨行質(zhì)控樣品中其低、中、高質(zhì)量濃度分別為0.12、0.40、2.0 μg/mL）。

2.1.3 供試品溶液 稱取360 mg 神經(jīng)酸對(duì)照品至燒杯中，加入食用菜籽油攪拌均勻至30 mL，得到120 mg/10 mL 高劑量油溶液，取15 mL，加入15 mL 食用菜籽油，混勻，即得60 mg/10 mL 中劑量油溶液，同法得到30 mg/10 mL低劑量油溶液。

2.2 LC-MS/MS 分析條件

2.2.1 色譜 SUPELCO Ascentis Express F5 C18反向色譜柱（10 cm×2.1 mm，2.7 μm）； 流動(dòng)相水-甲醇（含0.1% 甲酸） （17 ∶83）； 體積流量0.35 mL/min； 柱溫25 ℃； 進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源（ESI）； 正離子掃描； 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM） 模式； 霧化氣體積流量3 L/min； 加熱氣體積流量10 L/min； 接口溫度300 ℃； DL 溫度250 ℃； 加熱塊溫度400 ℃； 干燥器體積流量10 L/min，其他參數(shù)見表1。

表1 神經(jīng)酸質(zhì)譜條件

2.3 分組、給藥與采血 參考文獻(xiàn)［13-15］ 報(bào)道，24 只大鼠隨機(jī)分為4 組，分別為對(duì)照組（食用菜籽油） 及神經(jīng)酸低、中、高劑量組（30、60、120 mg/kg），禁食16 h 后以10 mL/kg 劑量灌胃給藥，于給藥前及給藥后0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12、14、24、36 h 眼眶取血各300 μL （其間每4 h 灌胃給予生理鹽水），4 000 r/min 離心15 min，取上層血漿，在-80 ℃下保存。

2.4 樣品前處理 取“2.1.2” 項(xiàng)下含藥血漿對(duì)照品溶液或“2.3” 項(xiàng)下血漿樣品100 μL，置于1.5 mL 離心管中，加入800 μL 乙酸乙酯，渦旋混勻5 min 后離心10 min，取700 μL上清，N2吹干，100 μL 甲醇復(fù)溶后振蕩混勻1 min，高速離心10 min，取上清液進(jìn)行分析。

2.5 數(shù)據(jù)處理 通過DAS 2.0 軟件中的擬合一室模型計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，SPSS 23.0 軟件進(jìn)行組間方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性試驗(yàn) 取按“2.4” 項(xiàng)下方法前處理的空白血漿、含藥血漿對(duì)照品溶液 （0.12 μg/mL）、含藥血漿（24 h，30 mg/kg） 適量，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，血漿中神經(jīng)酸出峰時(shí)間一致，均在3.7 min 左右，并且其色譜峰分離度和峰型均良好； 空白血漿中可見內(nèi)源性神經(jīng)酸色譜峰，其質(zhì)量濃度低于30 ng/mL，對(duì)測(cè)定不會(huì)造成實(shí)質(zhì)性干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 神經(jīng)酸專屬性色譜圖

3.1.2 基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 取不同體質(zhì)量大鼠的空白血漿6份，按“2.4” 項(xiàng)下方法前處理，提取空白基質(zhì)，加入神經(jīng)酸，制成低、中、高質(zhì)量濃度，即 0.12、0.40、2.0 μg/mL，混勻，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，以神經(jīng)酸在空白基質(zhì)血漿中的響應(yīng)峰面積與不含基質(zhì)甲醇中的響應(yīng)峰面積比值為基質(zhì)因子，測(cè)得3 個(gè)質(zhì)量濃度下分別為90.83% ～ 114.17%、93.05% ～ 104.53%、91.24% ～107.30%，總基質(zhì)因子為99.47%，在（100±15）% 以內(nèi)；RSD 分別為8.82%、4.16%、5.58%，總RSD 為6.19%，均小于15%，符合2020 年版《中國(guó)藥典》［16］所規(guī)定的生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則。

3.1.3 線性關(guān)系考察 按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)工作液，在“2.2” 項(xiàng)條件下各進(jìn)樣20 μL 測(cè)定。以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝31 684.8X＋5.273 31 （r＝0.999 4），在0.062 5～4.00 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。再按3 倍信噪比確定檢測(cè)限為0.31 ng/mL，10 倍信噪比確定定量限為1 ng/mL，并且最低限定量低于Cmax的1/20 ～1/10，在3 ～5個(gè)t1/2后仍能檢測(cè)，符合相關(guān)要求。

3.1.4 精密度、加樣回收率試驗(yàn) 取不同時(shí)間段3 批樣品溶液（“3.1.2” 項(xiàng)下低、中、高質(zhì)量濃度），平行5 份，采用同一臺(tái)儀器于同一天內(nèi)在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)精密度； 同法測(cè)定3 d，每天1 次，計(jì)算日間精密度。取大鼠含藥血漿適量，分別加入“3.1.2” 項(xiàng)下低、中、高質(zhì)量濃度樣品溶液，按“2.4” 項(xiàng)下方法前處理，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定3 次，計(jì)算回收率。結(jié)果，低、中、高質(zhì)量濃度下日內(nèi)精密度RSD 分別為3.44%、2.82%、3.54%，日間精密度RSD 分別為5.12%、4.42%、5.32%，均小于15%，表明該方法精密度良好； 神經(jīng)酸平均加樣回收率分別為（96.67±5.00）%、（95.75±0.75）%、（105.15±4.25）%，均在（100±15）%以內(nèi)。

3.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別考察在4 ℃、室溫、-80 ℃下放置1、3、6、9、12、24、48、72 h，以及在-80 ℃至室溫下反復(fù)凍融5 次時(shí)含藥血漿穩(wěn)定性，平行3 份。結(jié)果，含藥血漿在4 ℃下穩(wěn)定性良好，RSD 為2.67%； 室溫下神經(jīng)酸含量RSD 為6.30%，可穩(wěn)定放置24 h； 48、72 h 神經(jīng)酸含量略有下降； 反復(fù)凍融3 次后神經(jīng)酸含量RSD 為9.55%，但第4～5 次時(shí)其含量逐漸降低，RSD 升高。

3.2 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究 單次灌胃給予30、60、120 mg/kg神經(jīng)酸后，大鼠體內(nèi)代謝過程均符合一室模型，給藥前，大鼠血漿中神經(jīng)酸含量RSD 為38.73%，但對(duì)照組及各劑量組無顯著性差異（P＞0.05）； 對(duì)照組在不同時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)酸含量也無顯著性差異（P＞0.05），血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。

圖2 神經(jīng)酸血藥濃度-時(shí)間曲線（±s，n＝6）

采用基線校正法［17-19］，DAS 2.0 軟件中的擬合一室模型計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表2，可知AUC0～36h、AUC0～∞、Cmax均隨神經(jīng)酸劑量增加而升高 （P＜0.01）；Tmax、t1/2、MRT 分別為10.44、5.24、12.52 h，不同劑量組之間無顯著性差異（P＞0.05）。圖3 顯示，AUC0～36h、AUC0～∞、Cmax呈線性相關(guān)，R2分別為0.950 6、0.954 9、0.998 6。

圖3 AUC0 ～36 h （A）、AUC0 ～∞ （B）、Cmax （C） 與神經(jīng)酸劑量的線性關(guān)系

表2 神經(jīng)酸主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）

表2 神經(jīng)酸主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）

注： 與低劑量組（30 mg/kg） 比較，**P＜0.01。

參數(shù)單位低劑量組（30 mg/kg）中劑量組（60 mg/kg）高劑量組（120 mg/kg）t1/2h5.05±1.574.51±1.076.17±1.95 Ke1·h-10.27±0.090.21±0.060.23±0.08 V1/FL·kg-167.47±25.2545.52±9.3665.97±13.41 CL/FL·h-1·kg-113.07±4.787.59±0.9610.19±2.10 AUC0 ～36 hng·h·mL-17 282.93±1 265.7714 345.99±581.03**20 620.56±1 601.48**AUC0 ～∞ng·h·mL-18 062.52±1 470.8715 129.34±813.39**21 636.73±1 956.68**MRT0 ～36 hh13.18±1.3212.83±0.4111.53±0.68 MRT0 ～∞h14.23±2.1214.52±0.7912.97±1.33 Tmaxh11.33±1.1211.00±1.009.00±0.45 Cmaxng·mL-1491.80±26.76959.12±31.91**1 764.34±93.03**

4 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用乙酸乙酯進(jìn)行液液萃取，提取率較高，并建立LC-MS/MS 法測(cè)定大鼠血漿中神經(jīng)酸血藥濃度，其穩(wěn)定性良好，符合定量分析要求［15-16，19-20］。文獻(xiàn)［11-12，21-22］ 報(bào)道，人乳、血漿（清） 中含有內(nèi)源性神經(jīng)酸，但個(gè)體有差異； 本實(shí)驗(yàn)采用大鼠混合空白血漿作為基質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，排除了基底值干擾和基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)在藥動(dòng)學(xué)研究中采用基線校正法［17-19］，以對(duì)照組進(jìn)行對(duì)點(diǎn)校正，即各劑量組血藥濃度在所有采樣時(shí)間點(diǎn)均減去對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組血漿樣品濃度平均值，以排除溶劑、節(jié)律等可能產(chǎn)生的影響。

藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，單次給予大鼠神經(jīng)酸后血藥濃度對(duì)數(shù)-時(shí)間曲線具有雙峰現(xiàn)象，高劑量下更明顯，可能與胃排空時(shí)間和/或肝腸循環(huán)有關(guān)。另外，神經(jīng)酸藥動(dòng)學(xué)符合一室模型，在30～120 mg/kg 口服劑量范圍內(nèi)AUC、Cmax與劑量呈線性相關(guān)，即呈現(xiàn)劑量依賴性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)開展神經(jīng)酸在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的研究，可為該成分進(jìn)一步藥效學(xué)機(jī)制考察及安全性評(píng)價(jià)提供參考，為防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)藥物開發(fā)提供思路，同時(shí)也為云南省特色植物蒜頭果開發(fā)利用、打造優(yōu)勢(shì)產(chǎn)品奠定理論基礎(chǔ)。