健肝樂顆粒質量評價

張東方，魯曉光

（南陽市產品質量檢驗檢測中心，河南 南陽 473000）

健肝樂顆粒源于東漢張仲景《傷寒論·太陽篇》，由白芍、甘草組成，為經典名方發展而來的現代制劑。該組方具有養血護肝，解毒止痛的功效。具有降低轉氨酶，消褪黃疸以及改善各類肝炎臨床癥狀的作用，臨床用于治療急慢性病毒性肝炎。現執行標準［1］中無含量測定項，無法滿足中藥現代化的發展需求。目前，該復方制劑研究主要集中在臨床方面［2-5］，其質量控制研究［6］較少。且目前尚未見有關健肝樂顆粒指紋圖譜及化學模式識別的研究報道。在查閱文獻［7-14］ 的基礎上，發現該制劑雖然只有2 味藥材，但化學成分多而復雜。本實驗以中藥指紋圖譜結合聚類分析（HCA） 方法、主成分分析法（PCA） 以及正交偏最小二乘判別分析法（OPLS-DA） 將指紋圖譜提供的信息進行再評價。再根據不同入血成分保肝作用強弱不同，再經過實驗篩選，選取芍藥中沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷，甘草中甘草苷、芹糖甘草苷、異甘草苷、甘草酸銨作為指標成分，以期為提高健肝樂顆粒的質量標準提供依據，為優化生產工藝達到藥效最佳提供基礎。

1 材料

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；BP211D 型電子天平（德國賽多利斯公司）； WT-1200 型超聲波清洗器（濟寧萬通超聲儀器設備廠）。異甘草苷（批號17042102，純度98%）、芍藥內酯苷（批號19121705，純度99.28%）、芹糖甘草苷（批號20081705，純度98%）對照品（成都普菲德生物技術有限公司）； 芍藥苷（批號110736-201539，純度96.4%）、甘草酸銨 （批號110731-202021，純度96.2%）、沒食子酸 （批號110831-200803，純度 90.1%）、甘草苷 （ 批號 111610-201908，純度92.0%） 對照品（中國食品藥品檢定研究院）。健肝樂顆粒購于武漢康樂藥業有限公司，批號1322014、1323014、1322004、1323003、1323002、1322008、1220037、1222036、1222035、1222061、1322013、1322008、1323001、1323002、1220035、1220034，編號S1 ～S16，其中S1 ～S6、S11 ～S14 規格為15 g/袋，含蔗糖； S7 ～S10、S15～S16 規格為6 g/袋，無蔗糖。白芍、甘草購于市場，經南陽市產品質量檢驗檢測中心魯曉光副主任藥師鑒定為正品。甲醇、乙腈均為色譜純（美國GIOVINI Chemical 公司）； 水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Welchrom C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈（A） -0.3%磷酸（B），梯度洗脫（0 ～10 min，10% ～20% A； 10 ～22 min，20% A； 22 ～35 min，20% ～40%A； 35～50 min，40%A）； 體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃； 檢測波長230 nm； 進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、甘草苷、芹糖甘草苷、異甘草苷、甘草酸銨對照品適量，甲醇溶解并稀釋，制成質量濃度分別為25.21、24.71、92.84、11.86、12.69、3.74、46.95 μg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品適量，混勻研細，精密稱取0.5 g （S7～S10 各取0.2 g），精密加入25 mL 甲醇，稱定質量，超聲提取30 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液制備 按處方和工藝，分別制備缺白芍、缺甘草的陰性樣品，按 “2.2.2” 項下方法制備，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取本品（S1） 適量，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得各成分相對保留時間、相對峰面積（以峰8甘草苷為參照） RSD 均小于1.9%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取本品（S1） 適量，按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得各成分相對保留時間、相對峰面積（以峰8 為參照） RSD 均小于1.7%，表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取本品（S1） 適量，按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得各成分相對保留時間、相對峰面積 （以峰8 為參照） RSD 均小于2.0%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.4 HPLC 指紋圖譜建立

2.4.1 圖譜生成 取16 批樣品，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012） ”，設置S1為參照，時間窗寬度為0.3 min，生成方法為中位數法，全峰匹配結合多點校正，得到共有指紋圖譜和對照指紋圖譜（R），見圖1A。通過與對照品色譜圖（圖1B） 比對，確認峰1 為沒食子酸，峰4 為芍藥內酯苷，峰5 為芍藥苷，峰7 為芹糖甘草苷，峰8 為甘草苷，峰15 為異甘草苷，峰20 為甘草酸銨，并選取分離度好、峰面積穩定、保留時間適宜的甘草苷（峰8） 作為參照峰。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.4.2 色譜峰歸屬 依據單味藥材、對照品溶液的紫外光譜信息和保留時間進行比對，結果見圖1C～1D。由此可知，色譜峰1～5、9～10 歸屬于白芍，6～8、11～21 歸屬于甘草。

2.4.3 相似度評價 16 批樣品與對照指紋圖譜的相似度分別為0.986、0.985、0.996、0.996、0.995、0.996、0.974、0.992、0.991、0.989、0.985、0.985、0.997、0.997、0.985、0.992，表明不同批次、工藝樣品成分組成基本一致，質量均一性良好。

2.5 化學模式識別

2.5.1 聚類分析 （HCA） 采用SPSS 26.0 軟件，以Euclidean 距離為度量標準，通過組間對比法，以16 批樣品共有峰峰面積與相對峰面積為變量進行系統聚類［15-20］，結果見圖2。由此可知，以共有峰面積為變量時，16 批樣品聚為2 類，S1 ～S6、S8、S9、S11 ～S14、S16 為一類，S7、S10、S15 為一類，表明它們在成分含量上整體一致，但也具有一定的差異性，可能與生產工藝、投料量不同有關，但總體上不大； 以相對峰面積為變量時，16 批樣品可聚為2 類，S1～S5、S7～S16 為一類，S6 為一類。綜上所述，不同批次、規格、劑型樣品成分組成相似度高，質量穩定可靠。

圖2 16 批健肝樂顆粒聚類分析圖

2.5.2 主成分分析（PCA） 采用SIMCA 14.0 軟件對16批樣品共有峰峰面積進行PCA 分析，結果見圖3A。由此可知，21 個共有峰分成4 個主成分，16 批樣品分為2 類，S1～S6、S11～S14 為一類，S7～S10、S15～S16 為一類。

圖3 16 批健肝樂顆粒OPLS-DA 分析圖

2.5.3 正交偏最小二乘判別分析 （OPLS-DA） 采用SIMCA 14.0 軟件對16 批樣品進行OPLS-DA 分析，結果見圖3。由此可知，VIP 大于1 的成分有11 種，峰號分別為5～9、11、13、15、16、18、21；R2Y為0.992，Q2為0.977，均不小于0.50，表明模型穩定性、預測性良好［19-23］； 經200 次置換檢驗后Q2回歸線與縱軸的相交點小于零，表明模型不存在過擬合，可用于預測分析。

2.5.4 指標成分篩選 中藥質量標志物［21］（Q-marker） 可反映中藥安全性和有效性，并能進行定性定量分析。研究中藥質量標志物可提高質量一致性、可控性和溯源性，更好地控制中藥生產過程、進行質量監管。本實驗根據文獻［7-14］ 報道及上述結果，確定沒食子酸（峰1）、芍藥內酯苷（峰4）、芍藥苷（峰5）、芹糖甘草苷（峰7）、甘草苷（峰8）、異甘草苷（峰15）、甘草酸銨（峰20） 作為指標成分。

2.6 指標成分含量測定 采用HPLC 法。

2.6.1 溶液制備 同“2.2” 項。

2.6.2 色譜條件 同“2.1” 項。

2.6.3 系統適用性考察和專屬性試驗 取對照品、供試品（S1）、陰性樣品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，各指標成分分離度符合要求，理論塔板數均大于4 000，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.6.4 線性關系考察 分別取對照品溶液1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表1，可知各指標成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各指標成分線性關系

2.6.5 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、甘草苷、芹糖甘草苷、異甘草苷、甘草酸銨峰面積RSD 分別為1.8%、1.6%、1.0%、0.41%、0.92%、1.8%、1.2%，表明儀器精密度良好。

2.6.6 穩定性試驗 取同一份供試品溶液（S1），于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、甘草苷、芹糖甘草苷、異甘草苷、甘草酸銨峰面積RSD 分別為2.0%、0.82%、1.4%、1.3%、1.1%、2.0%、2.0%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.6.7 重復性試驗 取供試品溶液（S1） 6 份，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、甘草苷、芹糖甘草苷、異甘草苷、甘草酸銨含量RSD 分別為1.5%、1.4%、0.9%、2.0%、0.9%、0.5%、1.1%，表明該方法重復性良好。

2.6.8 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的樣品（S1） 0.25 g，共6 份，加入對照品溶液適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、甘草苷、芹糖甘草苷、異甘草苷、甘草酸銨平均加樣回收率分別為98.41%、97.51%、96.13%、95.59%、96.16%、97.62%、98.09%，RSD 分別為2.0%、1.9%、1.3%、1.6%、1.1%、1.1%、1.1%。

2.6.9 測定方法 取出16 批樣品內容物，混勻后研細，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表2。

表2 各指標成分含量測定結果（mg/袋，n＝3）

3 討論

3.1 提取方法選擇 先進行了提取溶劑的篩選實驗，結果表明在甲醇溶液中，待測成分提取較充分。進一步考察提取方式，分別比較了加熱回流30、120、150 min 及超聲處理30、40、60、90 min，結果顯示甲醇超聲處理30 min 時目標成分有效溶出。

3.2 色譜條件考察 考察了不同流動相，包括乙腈-水、甲醇-0.3%磷酸、乙腈-0.3% 磷酸、乙腈-0.3% 甲酸，發現乙腈-0.3%磷酸梯度洗脫時分離效果良好，保留時間適宜，色譜峰峰形佳。通過紫外掃描，發現7 種成分分別在258、230、360 nm 處得到最大吸收，230 nm 處7 種成分均有較強的紫外吸收，且基線最穩定。通過與文獻［22-26］ 及本實驗比較，發現波長切換法和230 nm 單波長測出的結果差異不大，考慮到基線穩定性和重復性，選擇230 nm 作為檢測波長。

3.3 指紋圖譜在復方中藥制劑分析中的應用及其作用 中藥質量影響因素包括植物種屬、采收期、栽培區域、貯藏條件、加工工藝等，進而造成成分差異，使其藥理活性及臨床應用也存在差異，并使中藥質量控制及評價成為復雜難題。指紋圖譜能夠與中醫“整體” 的傳統理論呼應，將多指標成分定量法與指紋圖譜結合，同時提供定性和定量信息，將是一種更適合、更有吸引力的用于復方中藥制劑的分析方法，能更好地揭示不同廠家批次間中藥制劑的細微差異。

在指標成分篩選過程中發現，該色譜系統還可同時分離測定芍藥、甘草中另外幾種具有保肝作用的指標成分丹皮酚、槲皮素、異鼠李素，但在該制劑中含量過低，暫不進行定量研究。中藥現代化的發展離不開對有效成分量效關系的深入研究，經典名方尤其應注重多組分的含量研究，以改進生產工藝，使制劑療效達到最佳。