復方佛耳草合劑對慢性阻塞性肺疾病大鼠TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路的影響

廖健杉，折 哲，李鳳森，石克華*

（1.上海中醫藥大學附屬市中醫醫院，上海 200071； 2.上海中醫藥大學附屬第七人民醫院，上海 200137； 3.新疆維吾爾自治區中醫醫院，新疆 烏魯木齊 830000）

慢性阻塞性肺疾病 （chronic obstructive pulmonary disease，COPD） 是以持續呼吸道癥狀與氣流受限為特征的肺部咳喘疾病，通常與遺傳因素及環境因素相關，其發病機制主要包括氣道氧化應激、炎癥反應及氣道重塑［1］。流行病學調查顯示，COPD 患者發病率和患病率呈逐年上升趨勢，預計到2050 年，我國COPD 患病人數或將達到2.15億［2］。中醫藥通過補肺納腎健脾，祛邪利氣，從而達到治療COPD 的目的，具有治療效果顯著、不良反應少、能有效降低復發率等優勢［3］。復方佛耳草合劑是上海中醫藥大學附屬市中醫醫院使用三十余年的中藥制劑，具有清熱化痰、止咳平喘之效，臨床主要應用于痰熱郁肺型疾病。本團隊前期臨床研究發現該方可迅速緩解COPD 患者咳喘癥狀，不僅能減輕肺部炎癥反應，而且對COPD 患者肺功能有保護作用［4-6］，但其機制仍需進一步研究。因此，本實驗采用煙草煙霧暴露聯合脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 建立COPD 大鼠模型，并基于Toll 樣受體4 （toll-like receptor 4，TLR4） /髓樣分化因子88 （myeloiddifferentiationfactor88，MyD88） /核轉錄因子-κB （nuclear factor kappa-B，NF-κB） 信號通路探討復方佛耳草合劑對COPD 大鼠潛在作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級Wistar 雄性大鼠60 只，6 周齡，體質量（180±20） g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司［實驗動物生產許可證號SCXK（滬） 2017-0005］，飼養于室溫（23±3）℃的環境，自由攝食和飲水。本實驗經上海中醫藥大學附屬市中醫醫院醫學倫理委員會批準 （ 倫理號dw2019015）。

1.2 藥物 復方佛耳草合劑由佛耳草、魚腥草、車前草、地龍、百部、陳皮、甘草等組成，由上海中醫藥大學附屬市中醫醫院藥劑科提供，批號20170923。醋酸地塞米松片購自上海上藥信誼藥廠有限公司，批號180313。

1.3 試劑 大前門香煙（上海煙草集團有限責任公司，批號20190115）； 脂多糖（LPS）、DMSO （美國Sigma-Aldrich 公司，批號L2880、D5879）； 腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD ）、丙 二 醛 （ malondialdehyde，MDA） 酶聯免疫吸附測定法（ELISA） 試劑盒、蘇木素伊紅（HE） 染色試劑盒、辣根過氧化物酶標記二抗、DAB 顯色試劑盒、RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL 化學發光試劑盒（上海碧云天生物技術股份有限公司，批號PT518、PI305、PI330、S0101S、S0131S、C0105、A0208、P0203、P0013B、P0010、P0018S）； TRIzol 試劑盒（美國英杰生命技術有限公司，批號14105）；TLR4 抗體、MyD88 抗體、NF-κB 抗體、TNF-α 抗體、β-肌動蛋白（recombinant human beta-actin，βactin） 抗體 （英國Abcam 公司，批號ab22048、ab133739、ab283716、ab183218、ab8226）。

1.4 儀器 染毒箱（自制，大小約80 cm×50 cm×40 cm，上方中央有可開啟的小口，周圍有12 個小的透氣孔）； AniRes2005 動物肺功能分析系統（北京貝蘭博科技有限公司）； 低溫高速離心機（美國Sigma-Aldrich 公司）； 酶標儀（上海百基生物科技有限公司）； 實時熒光定量PCR 儀、電泳儀（美國Bio-Rad 公司）； 凝膠成像儀（上海天能生命科學有限公司）。

2 方法

2.2 一般情況觀察 每天觀察各組大鼠咳嗽、喘鳴、氣促等情況，毛發、攝食飲水量、口鼻分泌物、精神狀態及死亡情況。

2.3 肺功能檢測 實驗第36 周末 （給藥結束后），各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）進行麻醉，切開頸部皮膚，暴露氣管，將靠進環狀軟骨的氣管以T 字形切開，插入軟管并用手術線固定，放入儀器體描箱內，確保箱子密閉性，檢測0.2 秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 0.2 second，FEV0.2）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、肺動態順應性（dynamic compliance，Cydn）、肺總阻力（lung resistance，RL）、呼氣相氣道阻力（expiratory airway resistance，Re） 等參數，重復檢測操作3 次。

2.4 標本采集 肺功能檢測結束后，腹主動脈采血5 mL，3 000 r/min 離心15 min，吸取上清，于-80 ℃保存； 脫頸處死大鼠，切開胸腔，立即取出肺組織，液氮保存備用。

2.5 肺組織病理學檢查 右肺下葉置于4% 多聚甲醛中固定，常規脫水，石蠟包埋，切片厚約4 μm，進行常規HE 染色，樹脂封片，在光鏡下觀察支氣管與肺泡病理改變。參照文獻［11］ 報道方法，對肺組織病理進行半定量評分。評分指標（1） 氣道是否存在阻塞； （2） 氣道上皮是否糜爛壞死； （3） 氣道上皮杯狀細胞化生； （4） 氣道上皮鱗狀細胞化生； （5） 管壁炎性細胞浸潤； （6）管壁纖維結締組織增生； （7） 氣道管壁平滑肌增生，評分標準正常為0 分，輕度損傷為1 分，中度損傷為2 分，重度損傷為3 分。每項指標分值合計，即得到病理學評分。

2.6 ELISA 法檢測血清炎癥因子水平 取各組大鼠血清，嚴格按試劑盒說明書操作，檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA 水平及SOD 活性。

2.7 RT-qPCR 法檢測肺組織TLR4、MyD88、NFκB、caspase-3 mRNA 表達 以TRIzol 一步法提取大鼠肺組織總RNA，反轉錄成cDNA。由生工生物工程（上海） 股份有限公司設計并合成引物，引物序列見表1。PCR 反應程序為94 ℃ 10 min，94 ℃30 s，72 ℃30 s，40 個循環擴增； 最后72 ℃10 min 結束反應。以β-actin為內參，結果采用2-ΔΔCT法計算各目的基因的表達。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.8 Western blot 法檢測肺組織TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α 蛋白表達 稱取肺組織60 mg 加入RIPA 裂解液中，置于冰上裂解，提取組織中總蛋白，使用BCA 法測定蛋白濃度。電泳分離相關蛋白，在低溫環境下轉膜，5%脫脂奶粉溶液封閉1 h后，加入一抗稀釋液 （TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、β-actin 分別按1 ∶500 稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST 充分洗滌后，加入二抗（1 ∶1 000） 室溫孵育1 h，TBST 充分洗滌后，加入ECL 顯色并掃描，以β-actin 為內參，采用Image J 軟件分析目的蛋白條帶光密度（OD） 值并計算目的蛋白表達量。

2.9 統計學分析 通過GraphPad Prism 7 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠一般情況 空白組大鼠精神狀態良好，毛色潔白有光澤，體型適中，活潑好動，反應靈敏，呼吸平穩，未見咳嗽、咯痰、打噴嚏等癥狀；與空白組比較，模型組大鼠精神萎靡，毛色枯黃少光澤，咳嗽、噴嚏頻發，反應緩慢，鼻分泌物增加，喉間痰鳴聲明顯，攝食減少，飲水量增加； 與模型組比較，地塞米松組和復方佛耳草合劑各劑量組大鼠氣喘、喉間痰鳴聲有不同程度減輕，精神狀態稍好轉，攝食量、飲水量均有所增加。實驗過程中無大鼠死亡情況發生。

伊拉克公司開發的米桑油田所在地是30多年前兩伊戰爭的主戰場，起初油田范圍內隨處可見地雷和未爆炸的炮彈、子彈。身處這樣的環境，說不害怕是不可能的，尤其是頭幾個月，連睡覺都是一種奢求。但我們知道這片“灘涂”闖過去就是“坦途”。米桑油田群項目是中海油首次作為主合同方管理的海外整裝油田，也是公司首次從無到有，全方位、全流程構建海外項目財務體系的一個絕佳時機。我們選擇在這片“荒蕪之地”暫時忘卻恐懼，只為建起一套海外項目的財務管理體系，能夠推廣適用于公司今后的海外項目。

3.2 復方佛耳草合劑對COPD 大鼠肺功能的影響 與空白組比較，模型組大鼠FEV0.2/FVC 降低（P＜0.01），Cdyn、RL 及Re 升高（P＜0.01），提示模型組大鼠存在阻塞性通氣功能障礙； 與模型組比較，地塞米松組和復方佛耳草合劑各劑量組FEV0.2/FVC 升高 （P＜0.05，P＜0.01），Cdyn、RL 及Re 降低（P＜0.05，P＜0.01），表明復方佛耳草合劑能延緩FEV0.2/FVC 下降趨勢，減輕氣道阻力，以高劑量組效果較佳，見表2。

表2 復方佛耳草合劑對COPD 大鼠肺功能的影響（±s，n＝6）Tab.2 Effects of Compound Fo’ercao Mixture on pulmonary function of COPD rats （±s，n＝6）

表2 復方佛耳草合劑對COPD 大鼠肺功能的影響（±s，n＝6）Tab.2 Effects of Compound Fo’ercao Mixture on pulmonary function of COPD rats （±s，n＝6）

注： 與空白組比較，＃＃P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別（FEV0.2/FVC）/%Cdyn/（mL·cm H2O-1）RL/（H2O·s·mL-1）Re/（H2O·s·mL-1）空白組93.02±7.610.341±0.3510.357±0.0400.234±0.010模型組60.36±5.01＃＃0.817±0.073＃＃0.801±0.080＃＃0.414±0.030＃＃地塞米松組86.20±4.91**0.468±0.050**0.446±0.065**0.309±0.021**復方佛耳草合劑低劑量組73.52±9.79*0.665±0.020*0.615±0.070**0.341±0.015**復方佛耳草合劑中劑量組80.71±6.65**0.498±0.124**0.522±0.064**0.324±0.045**復方佛耳草合劑高劑量組85.59±2.44**0.445±0.068**0.465±0.055**0.313±0.017**

3.3 復方佛耳草合劑對COPD 大鼠肺組織病理學的影響 空白組大鼠肺組織結構正常，支氣管管壁與肺泡形態完整，細胞排列結構有序，未見炎癥細胞彌漫浸潤； 模型組大鼠肺泡壁增厚，肺間質炎性分泌物大量增加，部分肺泡間隔斷裂融合形成較大含氣囊腔，部分黏膜上皮杯狀細胞變形、壞死； 地塞米松組和復方佛耳草合劑各劑量組大鼠肺組織氣道管壁與肺泡壁增厚、黏膜上皮變形及壞死、炎癥細胞浸潤及管腔狹窄均得到不同程度改善，其中復方佛耳草合劑低劑量組變化程度居于空白組與模型組之間，地塞米松組及復方佛耳草合劑高劑量組變化程度相似，均優于復方佛耳草合劑中劑量組，見圖1。與空白組比較，模型組大鼠肺組織病理評分升高（P＜0.01）； 與模型組比較，地塞米松組和復方佛耳草合劑各劑量組大鼠肺組織病理評分降低（P＜0.01），且復方佛耳草合劑的作用呈劑量依賴性，見表3。

圖1 各組大鼠肺組織病理圖（HE，×100）Fig.1 Pathology of rat lung tissue of each group （HE，×100）

表3 復方佛耳草合劑對COPD 大鼠肺組織病理評分的影響（±s，n＝6）Tab.3 Effects of Compound Fo’ercao Mixture on pathological score of rat lung tissue （±s，n＝6）

表3 復方佛耳草合劑對COPD 大鼠肺組織病理評分的影響（±s，n＝6）Tab.3 Effects of Compound Fo’ercao Mixture on pathological score of rat lung tissue （±s，n＝6）

注： 與空白組比較，＃＃P＜0.01； 與模型組比較，**P＜0.01。

組別評分/分空白組1.20±0.83模型組12.40±1.14＃＃地塞米松組6.20±0.83**復方佛耳草合劑低劑量組9.20±0.83**復方佛耳草合劑中劑量組8.00±0.70**復方佛耳草合劑高劑量組6.80±0.83**

3.4 復方佛耳草合劑對COPD 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA 水平及SOD 活性的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清SOD 活性降低（P＜0.01），TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，地塞米松組和復方佛耳草合劑各劑量組血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），地塞米松組和復方佛耳草合劑中、高劑量組血清SOD 活性升高（P＜0.01），提示復方佛耳草合劑可以恢復機體SOD 活性，調節COPD 大鼠血清中炎癥因子水平，且高劑量組效果較佳，見表4。

表4 復方佛耳草合劑對COPD 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA 水平及SOD 活性的影響（±s，n＝6）Tab.4 Effects of Compound Fo’ercao Mixture on serum TNF-α，IL-1β，IL-6 and MDA levels and SOD activity in COPD rats （±s，n＝6）

表4 復方佛耳草合劑對COPD 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA 水平及SOD 活性的影響（±s，n＝6）Tab.4 Effects of Compound Fo’ercao Mixture on serum TNF-α，IL-1β，IL-6 and MDA levels and SOD activity in COPD rats （±s，n＝6）

注： 與空白組比較，＃＃P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別TNF-α/（ng·L-1）IL-1β/（ng·L-1）IL-6/（ng·L-1）SOD/（U·mg-1）MDA/（U·mg-1）空白組38.57±8.5431.67±9.5934.24±8.0870.73±6.6212.41±2.64模型組158.73±9.96＃＃155.73±15.54＃＃151.75±9.96＃＃33.07±5.01＃＃28.40±3.01＃＃地塞米松組97.76±12.88**106.30±12.60**118.81±14.04**63.70±8.67**15.20±2.19**復方佛耳草合劑低劑量組126.42±6.53**132.12±8.45**127.08±14.06*45.68±4.9422.90±2.72*復方佛耳草合劑中劑量組104.67±10.20**111.68±10.45**124.30±5.83**50.92±6.37**17.24±1.48**復方佛耳草合劑高劑量組92.86±9.55**98.37±12.24**107.29±10.40**59.57±9.00**14.73±2.08**

3.5 復方佛耳草合劑對COPD 大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB、caspase-3 mRNA 表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB、caspase-3 mRNA 表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，地塞米松組和復方佛耳草合劑各劑量組大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB、caspase-3 mRNA 表達降低（P＜0.05，P＜0.01），且高劑量組效果較佳，見表5。

表5 復方佛耳草合劑對COPD 大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB、caspase-3 mRNA 表達的影響（±s，n＝6）Tab.5 Effects of Compound Fo’ercao Mixture on pulmonary mRNA expressions of TLR4，MyD88，NF-κB and caspase-3 of COPD rats （±s，n＝6）

表5 復方佛耳草合劑對COPD 大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB、caspase-3 mRNA 表達的影響（±s，n＝6）Tab.5 Effects of Compound Fo’ercao Mixture on pulmonary mRNA expressions of TLR4，MyD88，NF-κB and caspase-3 of COPD rats （±s，n＝6）

注： 與空白組比較，＃＃P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別TLR4MyD88NF-κBcaspase-3空白組1.24±0.381.66±0.291.15±0.141.31±0.04模型組6.32±0.41＃＃4.33±0.21＃＃4.75±0.90＃＃4.62±0.39＃＃地塞米松組2.61±0.41**2.85±0.51**1.75±0.44**2.64±0.37**復方佛耳草合劑低劑量組4.05±0.83**3.64±0.12*2.15±0.47**3.10±1.10**復方佛耳草合劑中劑量組2.77±0.53**3.08±0.39**1.70±0.27**2.86±0.67**復方佛耳草合劑高劑量組1.70±0.50**2.38±0.43**1.58±0.51**2.23±0.66**

3.6 復方佛耳草合劑對COPD 大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α 蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠肺組織TLR4、MyD88、NFκB、TNF-α 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，地塞米松組和復方佛耳草合劑各劑量組大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α 蛋白表達降低（P＜0.01），且高劑量組效果較佳，見圖2、表6。

圖2 各組大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α 蛋白條帶圖Fig.2 Protein bands of TLR4，MyD88，NF-κB and TNF-α in rat lung tissue of each group

表6 復方佛耳草合劑對COPD 大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α 蛋白表達的影響（±s，n＝6）Tab.6 Effects of Compound Fo’ercao Mixture on pulmonary protein expressions of TLR4，MyD88，NF-κB and TNF-α of COPD rats （±s，n＝6）

表6 復方佛耳草合劑對COPD 大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α 蛋白表達的影響（±s，n＝6）Tab.6 Effects of Compound Fo’ercao Mixture on pulmonary protein expressions of TLR4，MyD88，NF-κB and TNF-α of COPD rats （±s，n＝6）

注： 與空白組比較，＃＃P＜0.01； 與模型組比較，**P＜0.01。

組別TLR4MyD88NF-κBTNF-α空白組0.52±0.030.51±0.040.68±0.010.49±0.04模型組1.08±0.03＃＃1.31±0.04＃＃1.35±0.02＃＃1.07±0.02＃＃地塞米松組0.62±0.05**0.66±0.01**0.88±0.06**0.61±0.03**復方佛耳草合劑低劑量組0.84±0.03**0.75±0.05**0.93±0.02**0.88±0.01**復方佛耳草合劑中劑量組0.66±0.06**0.69±0.03**0.77±0.05**0.74±0.02**復方佛耳草合劑高劑量組0.55±0.05**0.62±0.02**0.67±0.02**0.62±0.01**

4 討論

COPD 在中醫學中屬于“喘證” “咳嗽” “肺脹” “痰飲” 等范疇，病機以肺脾腎氣俱虛為本，六淫實邪入侵為標，治療上應以清瀉肺熱、宣肺止咳、化痰平喘為治療法則［12］。復方佛耳草合劑組方中，重用佛耳草以清化肅肺而鎮咳平喘為君藥；魚腥草清熱消癰，清解肺中邪熱郁毒，車前草清熱祛痰，共為臣藥； 久病入絡，佐以地龍清熱、通絡、平喘，百部溫潤肺氣止咳，陳皮燥濕化痰兼理氣； 甘草止咳祛痰，調和眾藥為使。全方標本同治，潤燥相濟，共奏清熱化痰，宣肺平喘之效。

本研究通過煙草煙霧暴露聯合氣道注射LPS建立COPD 大鼠模型，發現COPD 大鼠肺通氣功能下降，存在氣道阻力，肺組織存在大量炎性浸潤，支氣管管壁增厚及管腔不規則狹窄，提示COPD 模型構建成功。給予復方佛耳草合劑干預后，大鼠肺組織炎性細胞浸潤明顯減少，有效延緩肺功能下降趨勢，改善氣道氣流受限癥狀，其中以高劑量組療效顯著，但其機制需進一步驗證。

大量研究證實，吸煙是COPD 最核心致病因素之一，可誘發氣道炎癥反應、激活氧化應激，進一步損傷氣道及肺部組織［13］。炎癥細胞活化將產生大量活性氧，引起肺部脂質過氧化增加，誘導細胞脂質受損［14-15］。當機體內氧化與抗氧化作用失衡，將引起異常細胞凋亡反應［16］。caspase 家族蛋白酶能夠直接導致凋亡細胞解體，其中caspase-3 被認為是凋亡的關鍵蛋白酶［17］。本研究結果顯示，與模型組比較，復方佛耳草合劑各劑量組血清SOD活性增加，MDA 水平及炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低，caspase-3 mRNA 表達下調，提示復方佛耳草合劑能夠減輕細胞膜過氧化損傷，抑制炎性細胞募集，減少肺泡上皮細胞凋亡相關基因的表達，從而發揮對COPD 大鼠肺組織保護的作用。

Toll 樣受體（TLR） 作為非特異性免疫系統識別病原體相關蛋白的一類受體蛋白［18］，在炎癥反應過程中發揮重要作用。TLR4 被認為是參與炎癥反應的主要Toll 樣受體，能夠與病原體細胞壁上的脂多糖發生特異性結合，激活其下游MyD88 依賴性或非依賴性途徑［19］，進一步誘導NF-κB 活化，刺激TNF-α、IL-6、IL-1β 及IL-18 等促炎因子表達［20］。研究表明，TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路參與了COPD 的炎癥反應和肺損傷過程［21］，控制COPD 炎癥反應與抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路相關蛋白有關［22］。本研究發現，模型組大鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB 基因和蛋白表達均升高，復方佛耳草合劑干預后，肺組織TLR4、MyD88、NF-κB 基因和蛋白表達降低，且作用呈劑量依賴性，提示復方佛耳草合劑可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路，進一步阻止細胞凋亡發生，減輕組織炎癥反應。

綜上所述，復方佛耳草合劑可改善COPD 大鼠的肺功能，對支氣管-肺組織損傷有保護作用，減少肺臟局部及全身性炎癥發生，糾正機體氧化/抗氧化失衡狀態，其作用機制可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路激活密切相關。然而，本研究僅進行體內實驗，后續需從細胞層面進一步闡述復方佛耳草合劑對TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路調控作用。