冠心生脈丸質量標準提升

劉靜玉，金武燮，谷麗華，2，吳立宏，2*，王崢濤，2*

（1.上海中醫藥大學中藥研究所，中藥標準化教育部重點實驗室，國家中醫藥管理局中藥新資源與質量評價重點實驗室，上海 201203； 2.上海中藥標準化中心，上海 201203）

我國中成藥產業發展迅速，目前臨床應用的品種已達九千余個［1］。但隨著中藥市場化的高速發展，加之資源短缺等問題，導致部分中成藥出現低限投料或少投料、使用近似品種摻加投料等影響質量的問題［2］，含貴細藥材者尤為突出，從而影響其臨床有效性和安全性［3-4］。

冠心生脈丸收錄于《中華人民共和國衛生部頒藥品標準（中藥成方制劑第六冊） 》，由人參、麥冬、五味子（醋炙）、丹參、赤芍、郁金、三七7 味藥材組成［5］。方中人參為君藥，性甘溫，益元氣，補肺氣，生津液； 三七與丹參、赤芍、郁金活血化瘀，擴張冠脈，其中郁金疏肝為氣中之血藥，三七祛瘀為血中氣藥，氣行血調而痛可自止［6］，臨床上用于治療心氣不足、心陰虛弱引起的心血瘀陰、心悸氣短、胸悶作痛、自汗乏力、脈微結代，冠心病、心絞痛、心律不齊等疾病［7-10］。但該制劑現行質量標準只有赤芍、丹參的定性鑒別，目前報道也大多為丹參、赤芍所含成分的含量測定［11-14］，而人參和三七作為方中貴細藥材，尚無定性定量評價方法，不利于其質量控制［15-16］。因此，本實驗以人參和三七為研究對象，建立TLC 定性鑒別和HPLC 含量測定方法，以期提升冠心生脈丸質量標準，有助于該制劑臨床療效穩定。

1 材料

1.1 儀器 Automatic TLC Sampler-4 薄層色譜全自動點樣儀（瑞士CAMAG 公司）； Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； BSA323S 電子天平（千分之一，德國Sartorius 公司）； AE200 電子天平［萬分之一，梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］； BT25S 電子天平（十萬分之一，德國Sartorius 公司）； SF-TGL-16M 離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）； M5800 超聲波清洗機（美國Branson 公司）； Accucore-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.6 μm） （美國Thermo Fisher Science 公司）；Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm） （ 美國 Agilent 公司）； Waters CORTECS C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）（美國Waters 公司）； TLC Silica gel 60 硅膠預制薄層板（批號HX066475，德國Merck 公司）； 銀龍GF254高效硅膠預制薄層板（批號20180310，煙臺市化學工業研究所）； G 型高效硅膠板 （批號20170209，青島海洋化工廠分廠）； DCFertigplatten DURASIL-20 硅膠預制薄層板 （德國MN 公司）。

1.2 試劑與藥物 人參（批號120917-201712）、三七（批號120941-201810） 對照藥材及人參皂苷Rg1（批號110703-202034）、人參皂苷Re （批號110754-202129）、人參皂苷Rb1（批號110704-202129）、人參皂苷Rd （批號111818-202104）、人參皂苷Rf （批號111719-201806）、三七皂苷R1（批號110745-201921）、擬人參皂苷F11（批號110841-202108） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。

人參（批號210325）、麥冬（批號210622）、五味子（批號210710）、丹參（批號210603）、赤芍（批號210416）、郁金 （批號210515）、三七（批號210721） 均由上海康橋中藥飲片有限公司提供，經上海中醫藥大學中藥研究所吳立宏研究員鑒定為正品，符合2020 年版《中國藥典》 一部規定［7］。冠心生脈丸共13 批（編號G1～G13），其中G1～G4 來自廠家1，G5～G8 來自廠家2，G9 ～G11來自廠家3，G12～G13 來自廠家4，組方藥材人參9 g、麥冬9 g、五味子（醋炙） 3 g、丹參15 g、赤芍12 g、郁金9 g、三七粉0.6 g，制備方法為除三七粉以外其余6 味藥材粉碎成細粉，與三七粉配研，過篩，混勻，每100 g 粉末加90 ～110 g 煉蜜，制成大蜜丸，即得。

乙腈為色譜純（美國Fisher 公司）； 甲醇等其他試劑均為分析純 （國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 TLC 定性鑒別

2.1.1 供試品溶液制備 取本品4 g，加2 g 硅藻土研細，加25 mL 乙酸乙酯超聲提取30 min，棄去提取液，加25 mL 水飽和正丁醇超聲提取30 min，取上清液，加氨試液洗滌3 次，每次50 mL，加25 mL正丁醇飽和水洗滌，取正丁醇層蒸干，加10 mL水超聲溶解，經D101 大孔樹脂 （內徑1.5 cm，柱高15 cm），加150 mL 水洗脫，棄去水液，150 mL 35%乙醇洗脫，棄去洗脫液，150 mL 40%乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加2 mL甲醇溶解，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rf 及三七皂苷R1、擬人參皂苷F11對照品適量，甲醇溶解，制成質量濃度分別為0.507、0.504、0.499、0.501、0.503、0.500 mg/mL 的溶液，即得。

2.1.3 對照藥材溶液制備 取人參、三七對照藥材各1 g，按“2.1.1” 項下方法制備，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液制備 按處方和工藝，分別制成缺人參、缺三七、缺人參和三七的陰性樣品，按“2.1.1 ” 項下方法制備，即得。

2.1.5 結果分析 按照2020 年版《中國藥典》四部通則0502，分別吸取供試品、陰性樣品溶液各8 μL，人參對照藥材溶液4 μL，三七對照藥材溶液1 μL，對照品溶液1 μL，點于同一硅膠薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13 ∶7 ∶2） 10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加熱至斑點顯色清晰，在可見光下檢視，結果見圖1～2。表明正品供試品色譜在對照藥材、對照品色譜相應位置上顯示相同顏色斑點，未檢出擬人參皂苷F11，陰性樣品色譜相應位置無干擾。

圖1 專屬性試驗TLC 色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of specific tests

圖2 13 批樣品TLC 色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of thirteen batches of samples

2.2 HPLC 含量測定

2.2.1 供試品溶液制備 取本品約4 g，精密稱定，加2 g 硅藻土研細，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 水飽和正丁醇，稱定質量，超聲（功率300 W，頻率40 kHz） 處理30 min，放冷，水飽和正丁醇補足減失的質量，搖勻，取上清液20 mL，用20 mL 氨試液洗滌，取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 對照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質量濃度分別為1.014、1.008、1.006、0.998 mg/mL 的貯備液，置于4 ℃冰箱中保存，取適量，甲醇逐級稀釋，分別得到含人參皂苷 Rg150.7、101.4、202.8、405.6、608.4、811.2、1 014.0 μg/mL，人參皂苷Re 50.4、100.8、201.6、403.2、604.8、806.4、1 008.0 μg/mL，人參皂苷 Rb150.3、100.6、201.2、402.4、603.6、804.8、1 006.0 μg/mL，人參皂苷Rd 49.9、99.8、199.6、399.2、598.8、798.4、998.0 μg/mL 的溶液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液制備 按處方和工藝，制成缺人參和三七的陰性樣品，按“2.2.1” 項下方法制備，即得。

2.2.4 色譜條件和專屬性試驗 Thermo Accucore-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.6 μm）； 流動相乙腈（A） -水（B），梯度洗脫（0 ～12 min，20%A； 12～15 min，20% ～26%A； 15 ～30 min，26% ～29%A； 30 ～38 min，29% A； 38 ～48 min，29% ～38% A； 48 ～55 min，38% A）； 體積流量 0.8 mL/min； 柱溫20 ℃； 檢測波長203 nm； 進樣量5 μL，色譜圖見圖3。由此可知，供試品、對照品色譜峰保留時間一致，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好； 理論塔板數按人參皂苷Re 計，應不低于5 000。

2.2.5 線性關系考察 精密吸取“2.2.2” 項下對照品溶液適量，在“2.2.4” 項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積（Y） 對其質量濃度（X）進行回歸，并以信噪比S/N ＝3 為檢測限，S/N ＝10 為定量限，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各人參皂苷線性關系Tab.1 Linear relationships of various ginsenosides

2.2.6 精密度試驗 取對照品溶液適量，同一天內在“2.2.4” 項色譜條件下進樣測定6 次，計算日內精密度； 同法連續測定3 d，每天3 次，計算日間精密度，測得人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 前者RSD 分別為0.90%、1.26%、0.98%、0.3%，后者 RSD 分別為 1.11%、1.69%、0.36%、1.04%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液（G4），于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.2.4”項色譜條件下進樣測定，測得人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 峰面積RSD 分別為0.25%、0.54%、0.56%、1.70%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.2.8 重復性試驗 精密稱取同一批本品（G4）6 份，按“ 2.2.1” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2.4” 項色譜條件下進樣測定，測得人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 含量 RSD 分別為0.35%、1.26%、1.02%、1.53%，表明該方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取各人參皂苷含量已知的本品（G4） 6 份，每份約2 g，精密加入100%水平的對照品溶液，按“ 2.2.1” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2.4” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd平均加樣回收率分別為 102.47%、98.10%、91.21%、106.86%，RSD 分別為1.29%、1.14%、1.43%、0.68%。

2.2.10 樣品含量測定 取5 個廠家13 批樣品適量，每批平行3 份，按“ 2.2.1” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2.4” 項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表2。

表2 各人參皂苷含量測定結果（mg/g，n＝3）Tab.2 Results for content determination of various ginsenosides （mg/g，n＝3）

3 討論

3.1 TLC 定性鑒別 皂苷類成分是人參和三七主要有效物質，其中人參皂苷Rg1、Re、Rb1為兩者共有成分，人參皂苷Rf 是前者特有成分［17］，三七皂苷R1是后者特有成分［18］，故本實驗選擇其作為鑒別指標。再分別對3 種展開劑、2 種顯色劑、4種薄層板進行考察，確定最佳色譜參數。然后，分別對供試品點樣量（6 ～10 μL）、展開溫度（4、25 ℃）、相對濕度（35%、58%） 進行考察，發現8 μL 時展開效果最佳，低溫下展開分離度更好，上述相對濕度范圍內展開情況穩定。

結果，樣品G1～G4 色譜在對照藥材、對照品色譜相應位置上顯示相同顏色斑點； G5 ～G13 中檢出西洋參特有成分擬人參皂苷F11［17］，但未檢出人參皂苷Rf 和三七皂苷R1，推測可能含有西洋參，而不含人參和三七。

3.2 HPLC 含量測定 本實驗以人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 為指標，分別對提取溶劑水飽和正丁醇用量（12.5、25、50 mL）、提取時間 （15、30、60 min）、氨試液用量（20、40、60 mL）、氨試液洗滌次數（1、2、3 次） 進行考察，以各成分檢出量和操作簡便性為原則，確定最優方案。再分別對體積流量 （0.6、0.8、1.0 mL/min）、柱溫（20、25、30 ℃）、色譜柱［Thermo Accucore C18（4.6 mm×150 mm，2.6 μm）、Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm × 150 mm，2.7 μm）、Waters CORTECS C18（4.6 mm×150 mm，2.7 μm） ］ 進行考察，根據分離度和分析時間確定最佳參數。

結果，13 批樣品均含有人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd，但不同批次之間的差異較大； 上述4 種人參皂苷含量總和，以及人參皂苷Rg1、Rb1含量比值（Rg1/Rb1） 在樣品G1～G4、G5～G13 之間存在明顯差異。研究表明，人參、三七和西洋參中Rg1/ Rb1分別約為1.13、1.14 和0.16［19］，并且兩者比值低于0.4 時為西洋參的標志［20-21］； 本實驗中樣品G1 ～G4 的Rg1/Rb1平均值為1.048±0.085，與文獻報道的人參和三七接近； G5 ～G13 其平均值為0.151±0.026，更接近西洋參。因此，為了有效控制冠心生脈丸質量，應對人參皂苷Rf、三七皂苷R1進行定性鑒別，人參和三七中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 進行含量測定。

根據上述實驗結果，結合投料量、工藝、檢測方法等因素，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 含量總和限度按平均值的30% 計算，建議不得低于1.0 mg/g； Rg1/Rb1穩定，其限度按3 倍標準偏差計算，建議不得低于0.79。

4 結論

本實驗針對冠心生脈丸中人參和三七，建立皂苷類成分TLC 定性鑒別、HPLC 含量測定方法，前者能有效分辨是否存在西洋參代替人參或三七投料，專屬性和實用性良好； 后者以人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 含量總和，以及人參皂苷Rg1、Rb1含量比值為指標確定限量值，可為該制劑質量標準提升提供參考。