靈芝miRNA對人皮膚成纖維細胞衰老的作用研究

余雯斌 徐曉淵 盛清

摘要： 為探究靈芝中miRNA對細胞衰老的干預作用及影響，利用過氧化氫（H2O2）誘導人皮膚成纖維細胞（Human skin fibroblasts，HSF）構建了細胞衰老模型，將靈芝特有的miRNA Glu-miR-01和Glu-miR-03轉染HSF衰老細胞，分析細胞衰老相關氧化應激指標，并通過Western blotting檢測衰老相關蛋白表達水平的變化。結果顯示：構建HSF細胞衰老模型的最適條件為H2O2濃度0.8 mmol/L，誘導時間3 h；Glu-miR-01和Glu-miR-03均能促使衰老細胞中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和總抗氧化能力（Total antioxidant capacity， T-AOC）水平上升，丙二醛（Malondialdehyde，MDA ）含量下降，細胞衰老相關β-半乳糖苷酶（Senescence associated-β-Galactosidase，SA-β-gal）染色陽性率降低，線粒體膜電位升高；衰老信號通路中P53、P21和P16蛋白的表達顯著降低，Rb蛋白表達顯著升高。該結果表明靈芝中Glu-miR-01和Glu-miR-03對HSF衰老細胞具有保護作用，并對衰老相關的p53/p21/Rb信號通路具有調控作用，為闡明靈芝miRNA對細胞衰老的分子作用機制提供了理論依據。

關鍵詞： 靈芝；miRNA；過氧化氫；氧化應激；細胞衰老；p53/p21/Rb信號通路

中圖分類號： Q936

文獻標志碼： A

文章編號： 1673-3851 （2024） 01-0120-10

引文格式：余雯斌，徐曉淵，盛清. 靈芝miRNA對人皮膚成纖維細胞衰老的作用研究［J］. 浙江理工大學學報（自然科學），2024，51（1）：120-129.

Reference Format： YU ?Wenbin，XU ?Xiaoyuan，SHENG ?Qing. Effect of Ganoderma lucidum miRNA on the senescence of human skin fibroblasts［J］. Journal of Zhejiang Sci-Tech University，2024，51（1）：120-129.

Effect of Ganoderma lucidum miRNA on the senescence of human skin

fibroblasts

YU ?Wenbin，XU ?Xiaoyuan，SHENG ?Qing

（College of Life Sciences and Medicine， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China）

Abstract： ?To investigate the intervention effect and impact of miRNA in Ganoderma lucidum （G. lucidum） on cell aging， we used hydrogen peroxide （H2O2） to induce human skin fibroblasts （HSF） and constructed a cell senescence model. The HSF senescent cells were transfected with miRNA Glu-miR-01 and Glu-miR-03， which were unique to G. lucidum， and the oxidative stress indexes related to cell aging were analyzed. The change of the expression levels of age-related proteins was detected by Western blotting. The results indicated that the optimal conditions for establishing the HSF cell senescence model were 0.8 mmol/L H2O2 and 3 h induction time. Both Glu-miR-01 and Glu-miR-03 could enhance the activity of superoxide dismutase （SOD） and total antioxidant capacity（T-AOC）， reduce the content of malondialdehyde （MDA）， decrease the positive rate of senescence-β-galactosidase （SA-β-gal） staining and increase mitochondrial membrane potential in senescence cells. In the aging signaling pathway， the expression of P53， P21 and P16 proteins was significantly downregulated， while the expression of Rb protein was significantly upregulated. These findings suggest that Glu-miR-01 and Glu-miR-03 from G. lucidum exert protective effects on HSF senescent cells， and regulate the p53/p21/Rb signaling pathway associated with aging. This provides a theoretical basis for elucidating the molecular mechanism of G. lucidum miRNA on cell senescence.

Key words： Ganoderma lucidum; miRNA; hydrogen peroxide; oxidative stress; cell senescence; p53/p21/Rb signaling pathway

0引言

靈芝（Ganoderma lucidum）是一種大型藥用真菌，擔子菌綱多孔菌科靈芝屬［1］。靈芝作為藥食同源的傳統中藥已有兩千多年的歷史，具有滋補強壯、延年益壽等功效，對多種不同疾病都有有益作用［2］。目前，對靈芝發揮藥效的物質基礎和作用機理研究主要集中在靈芝多糖、靈芝三萜及部分甾醇類物質等領域［3-5］，而對其核酸、蛋白質等初級代謝產物尤其是各種RNA的活性研究相對較少［6-10］。microRNA（miRNA）是一類含有18～25個核苷酸的非編碼小RNA（Non-coding small RNA），在動植物和微生物中普遍存在，能夠調控特定基因的轉錄后表達，在細胞增殖、分化和衰老等過程中起著重要的作用［11］。研究發現，miRNA參與不同細胞類型和環境老化過程，可作為重要的衰老生物學標志物［12］；miR-126等25種外泌體miRNA對血管細胞增殖、遷移、凋亡、炎癥和分化等衰老相關功能具有調控作用［13］。miRNA通過p53/p21/Rb通路、p16-pRb通路、PI3K/AKT/mTOR通路和SIRT1通路等多個與細胞衰老相關的信號通路參與細胞衰老的生物過程［14-15］。在衰老過程中，miRNA的表達改變與包括癌癥和心血管疾病在內的衰老性疾病有關，使用miRNA的治療方法將促進衰老相關疾病的治療或預防［16-17］。

2012年，Zhang等［18］首次發現，植物miRNA可以通過口服攝入調控人體內的基因表達；自此以來，越來越多的證據表明，外源miRNA可以調控動物體內相關基因的表達，發揮重要的生物學作用［19］。通過連續灌胃可顯著增加小鼠外周血和肺中金銀花miR2911的表達量，且合成的 miR2911 模擬物能顯著抑制H1N1 病毒的復制［20］；紅景天煎煮液中的miRNA在體內和體外實驗中均表現出較強的抗纖維化作用等［21］。Huang等［22］在對10種草藥的研究中發現，每種草藥中有大量小RNA能夠進入哺乳動物的血液和肺部，能以序列特異性的方式對哺乳動物基因進行跨界調控。

靈芝具有極高的藥用價值，是延緩衰老的珍品［23］；《神農本草經》記載，靈芝“久服輕身不老，延年神仙”［24］。現代藥理研究表明，靈芝多種活性成分具有延緩衰老的作用［25］，但其延緩衰老的分子機制尚有待進一步闡明。中藥miRNA可以發揮跨界調控作用，那么靈芝中的miRNA對衰老會有怎樣的作用和影響？Li等［26］首次報道了靈芝miRNA的鑒定研究，從靈芝子實體中分離并確證了132個已知miRNA和34個靈芝特有的miRNA；靶基因預測發現，靈芝中的miRNA針對人生命過程的靶基因多達111個，多數miRNA具有不止一個靶基因，或一個靶基因可以受多個miRNA調控，而豐度較高的靈芝特有miRNA Glu-miR-01、Glu-miR-03能夠靶向與衰老相關信號通路中的關鍵基因。

本文研究靈芝特有miRNA Glu-miR-01，Glu-miR-03對細胞衰老的作用。通過探究靈芝miRNA模擬物（miRNA mimics）對過氧化氫（H2O2）誘導的人皮膚成纖維細胞衰老的作用，檢測其對細胞衰老相關指標的變化、衰老相關通路關鍵蛋白的表達水平的影響等，探明靈芝miRNA作為靈芝新活性成分對延緩細胞衰老的作用及機制，為闡明靈芝miRNA跨界調控的分子機制奠定基礎。

1實驗部分

1.1材料

1.1.1細胞

人皮膚成纖維HSF細胞（美國模式培養物集存庫，ATCC）。

1.1.2miRNA模擬物

Glu-miR-01模擬物（Glu-miR-01 mimics）、Glu-miR-03模擬物（Glu-miR-03 mimics）和陰性對照（Negative control）（上海吉瑪制藥技術有限公司）按表1中序列制備。

1.1.3試劑

3%過氧化氫（H2O2）、噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）和胰酶（Trypsin）（美國Sigma公司），DMEM高糖培養基、雙抗（青霉素、鏈霉素）和PBS（維森特生物技術（南京）有限公司），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒和總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（南京建成生物工程研究所），胎牛血清（美國Gibco公司），細胞衰老相關β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色試劑盒、線粒體膜電位（JC-1）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），ECL顯色液（美國Advansta公司），LipofectamineTM3000轉染試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司），SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物醫藥科技有限公司）。

1.1.4抗體

p53（DO-1）抗體（1∶500）、p16INK4a（JC8）抗體（美國Santa Cruz公司，1∶500），p21Waf1/Cip1（DCS60）抗體（1∶2000）、Rb（4H1）抗體（美國Cell Signaling Technology公司，1∶2000），α-tubulin抗體（1∶5000）和羊抗兔IgG（HRP標記，美國Proteintech公司，1∶5000）。

1.2HSF細胞衰老模型的構建

采用H2O2誘導HSF細胞的方法構建氧化應激導致的HSF細胞衰老模型，具體參見文獻［27］。將HSF細胞鋪板過夜，設置H2O2濃度梯度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L和1.2 mmol/L，H2O2誘導的時間梯度為3、6、12 h和24 h，對 HSF 細胞進行 H2O2 誘導；經不同濃度、不同時間誘導后，觀察細胞形態的改變，采用MTT實驗檢測細胞活力的變化，以確定H2O2最適濃度與誘導時間；收集細胞后檢測SOD、MDA和T-AOC等氧化應激指標的變化，以確定HSF細胞衰老模型的成功構建。

1.3細胞中靈芝miRNA表達量的檢測

將靈芝miRNA mimics轉染HSF細胞后，收集細胞，提取細胞總RNA，以總RNA為模板，使用特異性莖環引物，將RNA 逆轉錄成cDNA。快速啟動通用SYBR Green Master的RT-qPCR程序，程序設置為：95 ℃處理10 min，然后95 ℃處理15 s，隨后轉為60 ℃處理15 s，最后72 ℃處理30 s，共40個循環，以人源5.8 S 為內參檢測miRNA的相對表達量。莖環引物和反轉錄引物序列見表2。使用ABI 7500 Software（V2.3）軟件進行數據分析。

1.4靈芝miRNA對衰老細胞活力影響的檢測

采用MTT法評價Glu-miR-01和Glu-miR-03對H2O2誘導的HSF衰老細胞的活力影響。將HSF細胞接種于96孔板中，細胞密度為2.5×104/孔。用質量濃度為0.75、3.5 μg/mL和7.5 μg/mL的Glu-miR-01 mimics、Glu-miR-03 mimics和對應陰性對照，分別轉染HSF細胞，每個濃度6個復孔。參照LipofectamineTM 3000轉染試劑說明書操作：取HSF細胞，棄去舊培養基，每孔加入2 mL無血清DMEM培養基。將轉染試劑、Glu-miR-01 mimics、Glu-miR-03 mimics以及陰性對照分別用無血清DMEM培養液按說明書比例稀釋混勻。將稀釋后的轉染試劑分別與已稀釋的Glu-miR-01 mimics/Glu-miR-03 mimics/陰性對照按照1∶1比例混勻。室溫靜置孵育15～20 min。將孵育充分的混合物分別加入設定孔中，繼續培養24 h后更換培養基，每孔加入200 μL含有0.8 mmol/L H2O2的培養基；誘導3 h后吸去培養基，再加入濃度為5 mg/mL的20 μL MTT溶液，在CO2培養箱中于37 ℃孵育4 h后加入150 μL DMSO溶液，搖勻，待結晶充分溶解后，使用酶標儀于波長570 nm處測定每個孔的吸光度值（OD）。細胞活力（Cell viability， CV）計算如式（1）所示：

CV/%=OD實驗OD對照×100（1）

其中：CV為細胞存活率，%；OD實驗為實驗組在570 nm處的吸光度；OD對照為對照組570 nm處的吸光度。

1.5衰老相關氧化應激指標和細胞SA-β-gal的檢測

氧化應激相關細胞衰老的特征性指標主要包括SOD、MDA和T-AOC等［28］。SOD是生物體內清除超氧陰離子自由基的一種重要的抗氧化酶，可以保護氧自由基機體免受氧自由基的損害；MDA是脂質與氧自由基形成的產物之一，其含量代表脂質過氧化的程度；T-AOC是指各種抗氧化物質和抗氧化酶等構成的總抗氧化水平，用于評價生物活性物質的抗氧化能力。選擇培養的HSF細胞接種于6孔板，使每孔細胞密度為 1×106個，分為0.8 mmol/L H2O2誘導的模型組、實驗組即0.8 mmol/L H2O2誘導+轉染Glu-miR-01 mimics（Glu-miR-03 mimics）的Glu-miR-01組（Glu-miR-03組）、0.8 mmol/L H2O2誘導+轉染陰性對照的陰性對照組，在轉染miRNA mimics 24 h后，吸去舊培養基，每組都分別加入1 mL含有0.8 mmol/L H2O2的DMEM培養基，培養3 h后收集細胞，進行SOD、MDA和T-AOC等氧化應激相關指標檢測。

細胞衰老相關β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）是檢測細胞衰老的常用指標，利用衰老細胞中SA-β-gal活性水平上升進行細胞染色［29］。正常細胞中僅觀察到零星的SA-β-gal陽性細胞；研究發現，長時間暴露于H2O2可導致細胞過早衰老，表現為細胞增殖受到抑制，SA-β-gal染色增強［30］。細胞衰老相關SA-β-gal的檢測參照以上分組并按照試劑說明書進行。

1.6細胞線粒體膜電位的檢測

線粒體膜電位（ΔΨm）用于評估線粒體的活力，線粒體膜電位ΔΨm的變化反映細胞衰老變化。熒光探針JC-1可用于檢測線粒體膜電位ΔΨm，細胞活力強時，ΔΨm較高，呈現紅色熒光，而ΔΨm較低時呈綠色熒光，提示細胞衰老凋亡［29］。選擇培養的HSF細胞接種于6孔板，使每孔細胞密度為 1×106個，分為正常細胞的正常組、0.8 mmol/L H2O2誘導的模型組、實驗組即0.8 mmol/L H2O2誘導+轉染Glu-miR-01 mimics（Glu-miR-03 mimics）的Glu-miR-01（Glu-miR-03）組、0.8 mmol/L H2O2誘導+轉染陰性對照的陰性對照組，在轉染miRNA mimics 24 h后，棄去舊培養基，除正常組外分別加入含有0.8 mmol/L濃度H2O2的DMEM培養基，培養3 h后使用線粒體膜電位試劑盒檢測每組細胞的線粒體膜電位ΔΨm變化。

1.7細胞中蛋白質表達量的檢測（Western blotting）

細胞衰老的作用機制包括p53、p21Cip1/Waf1、p16INK4a等衰老相關分子標志物的調控，以及Rb蛋白的磷酸化狀態（pRb /tRb）等［31］。p53受到DNA損傷和端粒侵蝕的刺激，導致P21表達增加，Rb蛋白去磷酸化，最終導致細胞復制性衰老［32］。P53的失活則促進衰老細胞的增殖，而P21缺乏則延緩衰老過程，提示p53/p21/Rb通路可能是調控細胞衰老的主要途徑之一。選擇在培養的HSF細胞，將Glu-miR-01 mimics和Glu-miR-03 mimics轉染至細胞中，24 h后加入0.8 mmol/L H2O2誘導細胞，3 h后收集細胞。用細胞裂解液提取總蛋白。采用 SDS-PAGE分離總蛋白，用免疫印跡法將總蛋白轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶與吐溫（pH 7.4）在室溫下封閉2 h后，用p53抗體、p16INK4A抗體、p21Waf1/Cip1抗體、Rb抗體在4 ℃過夜孵育，以羊抗兔IgG（HRP標記）作為二抗，使用ECL顯色液檢測蛋白表達。

1.8統計分析

所有數據都是以平均值±SD表示3個獨立實驗的平均值，采用GraphPad Prism 6.0軟件進行單因素方差A檢驗和LSD檢驗。當p值<0.05時，差異顯著。

2結果與討論

2.1H2O2誘導HSF細胞衰老模型的細胞活力變化

細胞衰老是由細胞內氧自由基堆積產生導致［33］，正常有氧代謝產生的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）對生物分子造成損害，并最終導致組織功能下降和衰老［34］。氧化應激導致的細胞衰老一直被視為衰老研究中經典的體外模型，H2O2是產生ROS的主要成分，H2O2誘導產生的氧化應激可引起人體皮膚成纖維細胞氧化損傷［35］。圖1為不同濃度H2O2誘導下HSF細胞的活力變化。圖1表明：當H2O2的濃度大于等于1.0 mmol/L時，經3 h誘導后細胞存活率CV約為50%，但經6 h以上誘導后，細胞存活率CV逐漸降低至20%以下，細胞大多數已經死亡。通過比較，最終選擇0.8 mmol/L為最適濃度，3 h為最適作用時間，確定為H2O2誘導氧化應激構建細胞衰老模型的最適條件。

2.2HSF細胞衰老模型中氧化應激指標的變化

圖2為H2O2刺激下HSF細胞內各氧化應激指標含量的變化。由圖2可知，相比于正常細胞組，在0.8 mmol/L H2O2誘導3 h的模型組中，SOD和T-AOC的水平顯著降低（p<0.01），而MDA含量相對于正常組顯著增加（p<0.05）。這些氧化應激指標的顯著改變，表明采用0.8 mmol/L H2O2、處理3 h的條件進行誘導的HSF細胞衰老模型構建成功，可用于后續實驗。

2.3靈芝miRNA在HSF細胞中的轉染效率

因為陰性對照組帶有熒光標記（FAM），并且其核酸結構與合成的miRNA mimics相似，所以其熒光強度可以近似反映出Glu-miRNA的轉染效率，圖3為轉染miRNA mimics 后細胞熒光強度，以及Glu-miR-01和Glu-miR-03在HSF細胞中的相對表達水平，由圖3（a）—（b）可知，Glu-miRNA的轉染效率相對較高；如圖3（c）—（d） 相對表達水平檢測實驗結果顯示，相比于對照組，實驗組中Glu-miR-01 和Glu-miR-03表達水平都有顯著升高，表明HSF細胞中Gas-miR-01 和Glu-miR-03都有較高的轉染效率。

2.4靈芝miRNA對HSF衰老細胞活力的影響

為了探究轉染靈芝miRNA對HSF細胞模型的影響是否具有劑量依賴性，在轉染不同濃度miRNA mimics后，對H2O2誘導的HSF細胞模型細胞活力的變化進行檢測。結果如圖4所示。由圖4可知，相比于只有正常細胞的正常組，模型組的HSF細胞由于一定濃度H2O2的誘導，細胞存活率CV明顯下降至正常組的50%～60%；而轉染靈芝miRNA mimics實驗組相比于模型組的細胞存活率明顯升高，并且不同濃度的Glu-miR-01mimics組細胞存活率CV顯著高于陰性對照組（p<0.01）；Glu-miR-03組具有相似的作用效果（p<0.05），說明轉染的靈芝miRNA mimics可以逆轉HSF的細胞活力，而跟劑量無關。

2.5靈芝miRNA對HSF衰老細胞中氧化應激指標和衰老細胞SA-β-gal生成的影響

圖5和圖6分別為Glu-miR-01、 Glu-miR-03對H2O2誘導的HSF細胞模型各個氧化應激指標的影響結果。圖5表明：相較于H2O2誘導后HSF細胞的SOD和T-AOC活性降低，MDA含量升高，轉染了靈芝miRNA mimics的HSF衰老細胞相應氧化應激指標發生了逆轉。轉染Glu-miR-01 mimics組SOD活力相對于只加入H2O2誘導的模型組顯著升高（p<0.01），而MDA含量顯著降低（p<0.01），T-AOC則明顯上升（p<0.05）。由圖6可知：Glu-miR-03 與 Glu-miR-01 具有一致的作用效果，SOD、MDA和 T-AOC 的變化亦呈顯著性差異（p<0.05）。

SA-β-gal活性變化結果如圖7所示。由圖7可知：H2O2誘導的模型組中SA-β-gal染色陽性細胞顯著增加，而轉染Glu-miR-01 mimics和轉染Glu-miR-03 mimics的HSF衰老細胞中SA-β-gal陽性占比均明顯低于模型組。這說明靈芝特異miRNA對緩解HSF細胞衰老具有一定作用。

2.6靈芝miRNA對HSF衰老細胞中線粒體膜電位ΔΨm的影響

圖8為靈芝miRNA對HSF細胞衰老模型中線粒體膜電位ΔΨm的影響結果。圖8表明，正常細胞中，紅色占比較高，而經H2O2處理的HSF中綠色熒光占比增加，表明衰老細胞增加，活力減弱，而經Glu-miR-01 mimics和Glu-miR-03 mimics分別處理HSF衰老細胞后，紅色熒光增加，相比于模型組具有顯著差異（p<0.05），表明靈芝miRNA mimics 逆轉了HSF衰老細胞的線粒體活力。

2.7靈芝miRNA對HSF衰老細胞中p53/p21/Rb信號通路的作用

越來越多的研究［14］證實，miRNAs可以參與衰老相關的信號通路如p53/p21/Rb通路的調節。因此，本文探究了靈芝miRNA對HSF衰老細胞中p53/p21/Rb信號通路相關蛋白的作用影響。圖9為靈芝miRNA對H2O2誘導的HSF細胞衰老模型中p53/p21/Rb信號通路上相關蛋白表達水平的影響結果。圖9表明：通過H2O2誘導的HSF衰老細胞所在模型相比于正常細胞組，P53、P21以及P16蛋白水平升高，Rb蛋白水平降低；轉染靈芝Glu-miR-01后，各蛋白表達水平發生了改變；相比于模型組，P53、P21和P16蛋白水平明顯下降，Rb蛋白水平顯著上升，結果由圖9（a）—（b）所示。轉染Glu-miR-03的結果與之一致，結果如圖9（c）—（d）所示。以上結果表明，靈芝miRNA mimics對衰老相關p53/p21/Rb信號通路的關鍵蛋白具有調控作用，提示靈芝特異miRNA可能通過調控p53/p21/Rb信號通路延緩HSF細胞衰老。

3結論

衰老是生命體發展必然的過程。氧化應激和氧自由基的堆積參與了衰老的發生發展，與衰老相關的信號通路有著密切的關系。本文探究了以延緩衰老著稱的中藥靈芝中特異miRNA對細胞衰老的作用及影響，主要結論如下：

a）靈芝特異Glu-miR-01和Glu-miR-03能夠使HSF衰老細胞的SOD和T-AOC水平上升，MDA含量下降，并且能減少SA-β-gal陽性細胞的生成，提高衰老細胞的線粒體膜電位，從而增強細胞的抗氧化能力，對衰老細胞具有積極的修復作用。

b）靈芝Glu-miR-01和Glu-miR-03都能下調HSF衰老細胞中p53/p21/Rb信號通路上的關鍵蛋白P53、P21、P16表達，上調Rb蛋白的表達，證明靈芝Glu-miR-01和Glu-miR-03對衰老細胞的p53/p21/Rb信號通路具有調控作用。本文為闡明靈芝特異miRNA對延緩衰老的作用機制提供了理論依據，為進一步研究靈芝miRNA跨界調控的分子機制奠定了基礎。

參考文獻：

［1］Lindequist U， Rausch R， Füssel A， et al. Higher fungi in traditional and modern medicine［J］. Medizinische Monatsschrift Für Pharmazeuten， 2010， 33（2）： 40-48.

［2］Sliva D. Cellular and physiological effects of Ganoderma lucidum （Reishi） ［J］. Mini Reviews in Medicinal Chemistry， 2004，4（8）：873-879.

［3］江艷， 王浩， 呂龍， 等. 靈芝孢子粉多糖Lzps-1的化學研究及其總多糖的抗腫瘤活性［J］.藥學學報， 2005，40（4）：347-350.

［4］Zhang H， Li W J， Nie S P， et al. Structural characterisation of a novel bioactive polysaccharide from Ganoderma atrum［J］.Carbohydrate Polymers， 2012，88（3）：1047-1054.

［5］Liu Y W， Gao J L， Guan J， et al. Evaluation of antiproliferative activities and action mechanisms of extracts from two species of Ganoderma on tumor cell lines［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2009，57（8）：3087-3093.

［6］Min B S， Gao J J， Nakamura N， et al. Triterpenes from the spores of ganoderma lucidum and their cytotoxicity against meth-A and LLC tumor cells［J］.Chemical & Pharmaceutical Bulletin， 2000，48（7）：1026-1033.

［7］陳若蕓， 于德泉. 用二維核磁共振技術研究赤芝孢子內酯A和B的結構［J］.藥學學報， 1991，26（6）：430-436.

［8］陳若蕓， 于德泉. 赤芝孢子粉三萜化學成分研究［J］. 藥學學報， 1991，26（4）：267-273.

［9］Min B S， Gao J J， Hattori M， et al. Anticomplement activity of terpenoids from the spores of ganoderma lucidum［J］. Planta Medica， 2001，67（9）：811-814.

［10］侯翠英， 孫義廷， 楊琳， 等. 靈芝（赤芝孢子粉）化學成分的研究再報［J］. Journal of Integrative Plant Biology， 1988，30（1）：66-70.

［11］Martinez I， Almstead L L， DiMaio D. microRNAs and senescence［J］. Aging， 2011，3（2）：77-78.

［12］Hooten N N， Fitzpatrick M， Wood W H， et al. Age-related changes in microRNA levels in serum［J］. Aging， 2013，5（10）：725-740.

［13］Du S S， Ling H， Guo Z Y， et al. Roles of exosomal miRNA in vascular aging［J］. Pharmacological Research， 2021， 165： 105278.

［14］荊霞， 熊興東， 劉新光.miRNAs與細胞衰老相關的信號通路［J］.中國生物化學與分子生物學報， 2013，29（5）：412-418.

［15］Zeng X L， Yang X N， Liu X J. Resveratrol attenuates cigarette smoke extract induced cellular senescence in human airway epithelial cells by regulating the miR-34a/SIRT1/NF-κB pathway［J］.Medicine， 2022， 101（46）： e31944.

［16］Li W G， Chen L N， Li W， et al. Unraveling the characteristics of microRNA regulation in the developmental and aging process of the human brain［J］. BMC Medical Genomics， 2013， 6： 55.

［17］Hodzic M， Naaldijk Y， Stolzing A. Regulating aging in adult stem cells with microRNA［J］. Zeitschrift Für Gerontologie Und Geriatrie， 2013，46（7）：629-634.

［18］Zhang L， Hou D X， Chen X， et al. Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1： evidence of cross-Kingdom regulation by microRNA［J］. Cell Research， 2012，22（1）：107-126.

［19］Luo Y， Wang P J， Wang X， et al. Detection of dietetically absorbed maize-derived microRNAs in pigs［J］. Scientific Reports， 2017， 7： 645.

［20］Zhou Z， Li X H， Liu J X， et al. Honeysuckle-encoded atypical microRNA2911 directly targets influenza A viruses［J］. Cell Research， 2015， 25（1）： 39-49.

［21］Du J C， Liang Z， Xu J T， et al. Plant-derived phosphocholine facilitates cellular uptake of anti-pulmonary fibrotic HJT-sRNA-m7［J］. Science China Life Sciences， 2019，62（3）：309-320.

［22］Huang F M， Du J C， Liang Z， et al. Large-scale analysis of small RNAs derived from traditional Chinese herbs in human tissues［J］. Science China Life Sciences， 2019， 62（3）： 321-332.

［23］Chiu H F， Fu H Y， Lu Y Y. Triterpenoids and polysaccharide peptides-enriched Ganoderma lucidum： a randomized， double-blind placebo-controlled crossover study of its antioxidation and hepatoprotective efficacy in healthy volunteers［J］. Pharmaceutical Biology， 2017，55（1）：1041-1046.

［24］林志彬. 靈芝的抗衰老與抗阿爾茨海默病的藥理研究進展［J］. 神經藥理學報， 2018，8（1）：9-15.

［25］張欣蕾， 王家傳， 趙紅. 中醫藥抗衰老的研究進展［J］. 深圳中西醫結合雜志， 2023，33（2）：129-133.

［26］Li B， Cheng X S， Zhang T， et al. The identification of microRNAs in Ganoderma lingzhi sporocarp［J］. Mycoscience， 2016， 57（4）： 271-278.

［27］潘長偉， 趙峰， 郎宏鑫，等. 過氧化氫誘導人皮膚成纖維細胞衰老模型的建立［J］. 解剖科學進展， 2019， 25（2）： 193-195， 199.

［28］Zhu Y， Han Y P， Wang W Y， et al. Mulberry leaves attenuate D-galactose-induced aging in vivo and in vitro［J］. Journal of Ethnopharmacology， 2023， 311： 116286.

［29］曹娟， 李玲玲， 姚瑤， 等. 氧化應激相關細胞衰老指標與骨關節炎的相關性探討［J］. 中華全科醫學， 2023，21（3）：396-400.

［30］Dimozi A， Mavrogonatou E， Sklirou A， et al. Oxidative stress inhibits the proliferation， induces premature senescence and promotes a catabolic phenotype in human nucleus pulposus intervertebral disc cells［J］. European Cells & Materials， 2015， 30： 89-102;discussion103.

［31］Campisi J， d′Adda di Fagagna F. Cellular senescence： when bad things happen to good cells［J］. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2007，8（9）：729-740.

［32］Feng C C， Yang M H， Zhang Y， et al. Cyclic mechanical tension reinforces DNA damage and activates the p53-p21-Rb pathway to induce premature senescence of nucleus pulposus cells［J］. International Journal of Molecular Medicine， 2018，41（6）：3316-3326.

［33］Beausjour C M， Krtolica A， Galimi F， et al. Reversal of human cellular senescence： roles of the p53 and p16 pathways［J］. The EMBO Journal， 2003，22（16）：4212-4222.

［34］Copeland J L. Exercise in older adults： the effect of age on exercise endocrinology［M］.Endocrinology of Physical Activity and Sport. Totowa， NJ： Humana Press， 2013： 437-460.

［35］Haan J B D， Bladier C， Lotfi-Miri M， et al. Fibroblasts derived from Gpx1 knockout mice display senescent-like features and are susceptible to H2O2-mediated cell death［J］.Free Radical Biology and Medicine， 2004，36（1）：53-64.

（責任編輯：張會巍）

收稿日期： 2023-05-29網絡出版日期：2023-07-14網絡出版日期

基金項目： 浙江省基礎公益研究計劃項目（LGF18H250004）

作者簡介： 余雯斌（1995—），男，杭州人，碩士研究生，主要從事中藥分子藥理方面的研究。

通信作者： 盛清，E-mail：csheng@zstu.edu.cn