春季池塘養殖病害綜合防治技術

楊 娟，丁豐源，康鵬天，王秀琴，張國維

(甘肅省漁業技術推廣總站，甘肅 蘭州 730030)

入春以來，甘肅地區一養殖池塘魚病害頻發，損失嚴重，筆者通過病樣采集、細菌分離鑒定及藥敏試驗，科學指導了養殖生產過程中的細菌病防治。

一、細菌分離鑒定及藥敏試驗

1.主要癥狀 鰓部充血、鰭條出血、皮膚潰瘍、鱗片脫落、黏液增多，解剖可見腹水、內臟出血、水腫等癥狀，初步診斷為細菌性感染。

2.樣品處理 將病魚在無菌環境下剖解，取內臟置于無菌平皿中，用滅菌剪刀剪取其橫斷面，制備菌液。

3.藥敏試驗 將菌液取100微升涂板，貼藥敏紙片，18℃下培養20 小時，測定抑菌圈直徑，參照NCCLS 的判斷標準進行結果判定，顯示頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、阿米卡星和左氟沙星抑菌效果最佳。

4.細菌分離純化 在普通營養瓊脂平板劃線接種，18℃培養24 小時，觀察平板細菌生長情況，根據菌落的形態特點，挑取多個典型單菌落，涂片，鏡檢。如此反復，直到純化為單一菌落。

5.16S rRNA 序列分析 根據TIANamp Bacteria DNA Kit 試劑盒說明書提取分離菌株的基因組DNA。

根據平板上菌落的顏色、形態、大小等特征挑取不同菌落于含LB 液體培養基的試管中(共12 管)，18℃過夜培養，第2 天依據細菌DNA 提取試劑盒的操作流程分別提取12株細菌的DNA，并進行PCR 擴增。反應體系：Premix Taq?(Ex Taq?Version 2.0 plus dye)12.5 微升，DNA 模板1 微升，上、下游引物各1 微升，dd 水補足至25 微升。反應條件：95℃預變性3 分鐘，95℃變性30 秒，退火55～65℃，延伸90 秒，Cycle 39×，再延伸5 分鐘，4℃下保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳并查看結果。

將PCR 產物條帶切割，放入1.5 毫升離心管中，根據膠回收試劑盒的操作流程分別對12 株菌落進行膠回收。最終將PCR膠回收產物再次用瓊脂糖凝膠驗證后送金唯智公司進行16S rRNA測序。

圖1 純化后的PCR擴增產物

金唯智公司測序返回的12 株細菌序列分別進行拼接并在NCBI中比對，結果見表1。

表1 菌株16S rRNA 序列分析

通過對病魚主要組織和內臟器官進行初步診斷及病原菌分離、16S rRNA 擴增和測序，檢測到假單胞菌、腐敗希瓦氏菌、溫和氣單胞菌、紫色桿菌等多種病原菌，并通過藥敏試驗，篩選出氯霉素、復方新諾明等敏感藥物，為科學指導養殖生產過程中的細菌病防治提供了一定依據。

二、春季魚病害綜合防治措施

1.徹底清塘消毒，殺滅病原菌 干塘后清除雜草和池底淤泥，修整并加固塘埂。經修整過的池塘暴曬15～20 天，然后用150～200 千克/畝的生石灰溶液全池潑灑，隨即均勻翻耙底泥。排水困難的魚塘，可帶水清塘，水深為0.8～1 米時，用120～150千克/畝的生石灰溶液全池潑灑。生石灰除可殺滅野雜魚和病原菌外，還能改良底質、中和酸性、提高pH、釋放營養素，保證有機物質的良性循環，同時還能補充塘魚發育生長所需的鈣質。

2.抓水質管理，保持水環境穩定 春季氣溫較低時，養殖池塘通常將水位調節為50～60 厘米，這樣有利于水溫的升高。在水體溫度達到10℃以上時開始加注新鮮水，加水應堅持少量多次的原則，以防水溫驟降，同時應適當施有機肥，以利提高水溫。遇連續陰雨天氣時，氣壓較低，水體易缺氧，要適當增加水深，以防水溫變化幅度過大，減少魚應激。

3.提早開食，科學投喂 當池塘水溫上升到10℃以上時，一般的水產養殖動物已開始攝食，攝食量隨水溫的升高而逐漸增大，應及早開食，投喂新鮮質優的飼料，促進魚體質的恢復。此時需隔天投餌1次，投餌量為魚體重的1%左右；當池塘水溫達到15℃以上時，開始正常投喂，每天上午9:00—10:00、下午3:00—4:00各投餌1次，投餌量為塘魚體重的3%～5%。投飼時必須嚴格遵循“四定和四看”原則，即：定時、定位、定質、定量和看天氣、看水質、看季節、看吃食情況。

4.加強越冬管理 一是越冬前強化培育。在越冬之前要多投喂一些富含蛋白質、脂肪的飼料，提高越冬魚肥滿度，使其能夠順利越冬。二是防止魚體凍傷。在冬季適當提高水位，保持相對穩定的水溫，防止魚體凍傷，有利于增強魚體抗寒能力和抗應激能力。三是規范操作，防止魚體機械損傷。冬季拉網、并塘、轉塘、運輸過程中，要規范操作，防止魚體受傷。

5.準確診斷，科學用藥 根據細菌分離鑒定及藥敏試驗結果，可選用頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、阿米卡星和左氟沙星等抗生素類藥物進行對癥治療。