抑制髓樣細胞觸發受體-1(TREM-1)減輕慢性間歇性低氧誘發的模型小鼠動脈粥樣硬化

余晗俏，李 超，余育斌，馮麗娜，盛曉生，葉曉霞，王林燕

1.金華市人民醫院 心內一科，浙江 金華 321000；2.金華市金東區第二人民醫院 全科醫學科，浙江 金華 321000

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea,OSA)是在睡眠期間反復出現呼吸暫停,并導致上呼吸道塌陷和間歇性低氧血癥[1]。OSA與心血管疾病有關,其慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia,CIH)的特征會導致內皮功能障礙和動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)發生發展[2]。促炎性巨噬細胞與AS發生、預后發展密切相關,能夠通過吞噬動脈血管內皮下脂蛋白形成泡沫細胞,導致AS發生發展,與AS斑塊的不穩定性及AS不良預后密切相關[3-4]。髓樣細胞觸發受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1,TREM-1)是一種在成熟單核細胞、巨噬細胞上表達的蛋白質,參與炎性信號放大[5-6]。實驗證明,TREM-1與促炎性巨噬細胞活化及AS發生發展相關[7],但是抑制TREM-1對AS作用尚不得知。本研究旨在探究抑制TREM-1對AS的作用及潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:雄性ApoE-/-小鼠購于北京維通利華公司。

1.1.2 試劑:TREM-1抑制劑LR12(MCE公司);TNF-α、IL-1β、IL-10 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);Trizol試劑、反轉錄試劑盒、SYBR Green PCR master mix(北京天根生化公司);油紅O染液(上海碧云天生物技術公司);TREM-1抗體、CD68抗體、FITC標記二抗、Alex Flour 594標記二抗(Abcam公司);高脂飼料(北京華阜康生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理:將ApoE-/-小鼠隨機分為空白組(blank,小鼠飼養在正常氧氣環境下,給予普通飼料喂養)、模型組(model,將小鼠置于6%氧氣艙維持20 s,轉入20%氧氣艙,維持該濃度20 s,如此操作每天循環240次,連續12周,期間小鼠予以高脂飼料飼養)和實驗組(experiment,小鼠高脂飼料飼養4周后,腹腔注射TREM-1抑制劑LR12,5 mg/kg,每天1次,連續干預8周,其他干預條件與模型組一致),每組8只。

1.2.2 ELISA檢測血脂及血清炎性因子:飼養12周后,取小鼠外周血,離心,取血清。采用生化免疫分析系統檢測血清TC、LDL、TG水平;采用TNF-α、IL-1β、IL-10 ELISA試劑盒檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平,具體方法參照ELISA試劑盒說明書。

1.2.3 RT-qPCR檢測mRNA:取小鼠主動脈,采用Trizol法提取組織中RNA,然后反轉錄獲得cDNA,采用qPCR檢測主動脈中TREM-1 mRNA表達水平。TREM-1引物:上游,5′-GATGTCGAGAGTCCC AATGA-3′,下游5′-GCTGGCATTCTGAGGCAAAA-3′;GAPDH引物:上游,5′-GATTAGCCGAGGTATAGCCA-3′,下游5′-ACTTGGAGCTTCGGACAAGA-3′。

1.2.4 HE染色及油紅O染色檢測主動脈根部或主動脈:將小鼠心臟及分離的主動脈放入含有4%多聚甲醛的離心管中固定。取小鼠心臟,然后用剪刀將心臟橫切分為兩部分,分離主動脈根部,使用optimal cutting temperature(OCT)包埋劑包埋主動脈根部切片,制備切片。同時取固定好的主動脈,縱向剖開,將其展開固定在蠟臺上。將制備的主動脈根部切片進行HE染色,將制備的主動脈根部切片機展開的主動脈進行油紅O染色。

1.2.5 免疫熒光(immunofluorescence,IF)染色檢測TREM及巨噬細胞:取上述主動脈根部冰凍切片,山羊血清封閉,抗小鼠TREM-1抗體(1∶1 000)、抗小鼠CD68抗體(1∶1 000)孵育,之后使用FITC、Alex Flour 594標記抗兔及大鼠二抗體孵育,DAPI封片,在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 CIH誘發動脈粥樣硬化小鼠主動脈斑塊TREM-1表達水平

空白組主動脈上有少量斑塊及炎性細胞浸潤,模型組主動脈上有大量斑塊沉積及炎性細胞浸潤。模型組主動脈斑塊TREM-1蛋白及mRNA及表達水平顯著高于空白組(P<0.05)(圖1,表1)。

表1 動脈粥樣硬化模型小鼠主動脈斑塊TREM-1表達水平

圖1 動脈粥樣硬化模型小鼠主動脈斑塊TREM-1表達量檢測Fig 1 Detection of TREM-1 expression in aortic plaque of atherosclerosis in satherosclerotic mouse model

2.2 阻斷TREM-1減少CIH誘發的動脈粥樣硬化斑塊沉積

實驗組主動脈及主動脈根部斑塊面積顯著少于模型組(P<0.05)(圖2,表2)。

*P<0.01 compared with blank; #P<0.01 compared with model.

2.3 阻斷TREM-1對CIH誘發的動脈粥樣硬化模型小鼠血脂的影響

實驗組小鼠血漿TC、TG、LDL水平顯著低于模型組(P<0.05)(圖3)。

TC.total cholesterol; TG.triacylglycerol; LDL: low density lipoprotein; *P<0.01 compared with blank; #P<0.01 compared with model.

2.4 阻斷TREM-1對CIH誘發的動脈粥樣硬化模型小鼠炎性因子水平影響

實驗組小鼠血漿TNF-α、IL-1β顯著低于模型組,且IL-10水平顯著高于模型組(P<0.05)(圖4)。

*P<0.01 compared with blank; #P<0.01 compared with model.

2.5 阻斷TREM-1對CIH誘發的動脈粥樣硬化模型小鼠斑塊巨噬細胞浸潤的影響

實驗組主動脈斑塊巨噬細胞及TREM-1水平顯著少于模型組(P<0.05),且斑塊中TREM-1與巨噬細胞共定位(圖5)。

Green.TREM-1; Red.macrophages (CD68); Blue.nucleus (DAPI); *P<0.01 compared with blank; #P<0.01 compared with model.

3 討論

OSA的特點是睡眠期間呼吸反復暫停,可導致上氣道塌陷和CIH[8-9]。CIH是OSA的一個顯著特征,其可產生多種炎性細胞因子,也是造成OSA患者AS損害的基礎[4],但具體調控機制尚不明晰。研究表明TREM-1與AS發生發展有關[10]。TREM-1可通過影響機體脂質代謝,促使泡沫細胞生成,進而影響并促進AS進展研究指出血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)和樹突狀細胞的TREM-1表達可促進動脈斑塊的不穩定性[7]。在臨床比較有癥狀和無癥狀AS斑塊的研究中,發現與無癥狀斑塊相比,有癥狀斑塊中TREM-1的表達顯著上調;與來自無癥狀斑塊的VSMCs相比,來自有癥狀斑塊的血管平滑肌細胞與強效炎性細胞因子TNF-α的刺激誘導了TREM-1的更高表達[11]。本研究發現CIH誘導的動脈粥樣硬化模型小鼠主動脈斑塊中TREM-1 mRNA及蛋白表達水平顯著升高。為進一步探究TREM-1在CIH誘導AS中作用,本研究采用TREM-1特異性拮抗劑LR12在CIH誘導AS發生過程進行干預,發現拮抗TREM-1能夠顯著的減少CIH誘導的ApoE-/-小鼠主動脈及主動脈根部斑塊沉積,表明TREM-1在CIH誘導動脈粥樣硬化中扮演重要角色。

在OSA導致AS的眾多因素中,炎癥和血脂異常是其中最重要的因素[8,12]。血漿中的LDL-C在內皮損傷或功能失常時附著血管壁,然后被進入內皮下的M1型巨噬細胞吞噬,使巨噬細胞泡沫化,促進AS的發生發展[12-13]。本研究發現,拮抗TREM-1組小鼠血漿TC、TG、LDL水平顯著低于模型組小鼠,且血漿TNF-α、IL-1β顯著低于模型組,IL-10水平顯著高于模型組,表明拮抗TREM-1抑制AS發生發展可能是通過抑制血脂及炎性反應。研究顯示,TNF-α、IL-1β、?劄?L-10在巨噬細胞激活過程扮演重要角色[14]。CIH可作為一種炎性刺激,誘導巨噬細胞向M1型極化,促進IL-6的表達[15]。巨噬細胞可分泌表達TREM-1,提示TREM-1可能通過調控巨噬細胞激活調控AS發生發展。進一步對AS斑塊中M1型巨噬細胞進行染色發現,抑制TREM-1小鼠CIH誘導AS斑塊M1型巨噬細胞及TREM-1表達顯著低于模型組,且二者熒光信號共定位,提示可能巨噬細胞分泌的TREM-1通過調控巨噬細胞激活,繼而調控AS發生發展。

綜上所述,TREM-1參與CIH誘發的動脈粥樣硬化發生發展,抑制TREM-1可以緩解CIH誘發的動脈粥樣硬化,其機制與抑制巨噬細胞活化有關。