結節性硬化癥5個家系致病變異的鑒定

劉思邑，楊玉姣，楊 濤，趙秀麗

中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 醫學遺傳學系疑難重癥及罕見病全國重點實驗室，北京 100005

結節性硬化癥(tuberous sclerosis complex,TSC;OMIM 191100或613254)是一種多系統發作的常染色體顯性遺傳病,發病率為1×10-4～6×10-3,無種族或性別差異[1]。據估計,全世界有約100萬人受到該疾病的影響[2]。TSC的臨床特征是發生在腦、皮膚、心臟、腎臟和肺等多個器官的錯構瘤,以及與之伴隨的癲癇、學習困難、行為問題、腎衰竭等并發癥狀。TSC的臨床表現在個體之間可能存在較大差異。幾乎所有的TSC患者的病癥都會在皮膚上有所體現[3],大約90%的TSC患者有局灶性色素減退,75%的患者有面部血管纖維瘤,50%的患者會出現皮膚增厚的癥狀,20%～80%的患者指甲會異常生長。超過90%的TSC患者中樞神經系統受到影響,存在癲癇、學習困難、行為問題和自閉癥等;60%～80%的TSC患者患有血管平滑肌脂肪瘤、囊腫和腎細胞癌等;30%～50%的TSC患者患有多發性視網膜錯構瘤,以及發生在肺部的淋巴管平滑肌瘤病(lymph angioleio myomatosis,LAM)和心臟橫紋肌瘤等。此外,部分TSC患者還有其它臨床表現,如神經內分泌腫瘤、肝血管平滑肌脂肪瘤和甲狀腺乳頭狀腺瘤,但發生率相對較低。

盡管1910年[4]就有國外學者報道結節硬化癥為一種遺傳性疾病,但直到20世紀90年代才通過多重連鎖分析確定結節硬化癥的致病基因為TSC1和TSC2。在所有發現TSC1或TSC2致病變異的TSC患者中,約有三分之二為TSC2變異。另有10%～15%臨床診斷為TSC的患者在TSC1或TSC2中均未發現致病變異[5],提示可能存在位于這兩個基因非編碼區致病變異、或其它新基因的致病變異。

本研究對5個結節性硬化癥患者家系進行了TSC1/TSC2致病變異檢測,為明確臨床診斷、探究遺傳病因、以及風險家庭再次妊娠產前基因診斷提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象:選取2020年1月至2021年7月間在中國醫學科學院基礎醫學研究所進行遠程遺傳咨詢的5個無關TSC家系的8例患者為研究對象。8例患者均表現出不同程度的TSC臨床癥狀,被擬診為TSC;在獲得研究對象(或監護人)知情同意后,收集患者臨床資料并采集先證者及其家系成員外周血樣本進行致病變異鑒定。本研究獲中國醫學科學院基礎醫學研究所倫理委員會批準(編號:015-2015),所有參與者均簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑:Tris平衡酚、乙二胺四乙酸二鈉、三氯甲烷、瓊脂糖、無水乙醇和異丙醇(國藥集團化學試劑有限公司);蛋白酶K、dNTP(Sigma-Aldrich 公司);瓊脂糖凝膠DNA片段回收試劑盒(Thermo Fisher Scientific 公司);TaKaRa LA Taq with GC Buffer、TaKaRa Ex Taq、TaKaRa DNA Fragment Purification Kit(寶日醫生物技術有限公司);PCR引物(北京諾賽基因組有限公司);Nimblegen SeqCap EZ Choice Library試劑盒(Roche 公司)。

1.2 方法

1.2.1 提取基因組DNA:采集先證者及其家系成員外周血(3 mL/人份),EDTA抗凝,采用常規酚-氯仿法提取基因組DNA,經Nanodrop進行純度和濃度鑒定,-20 ℃保存備用。

1.2.2 基因組panel測序檢測候選致病變異:采用包括TSC1/TSC2等154個本實驗室重點關注單基因病候選致病基因的個性化定制基因組測序panel進行目標區域捕獲,對先證者進行候選基因靶向測序(panel sequencing,PS)。使用1%的瓊脂糖電泳檢測DNA樣品的純度及完整性,經Qubit?3.0 Flurometer(Life Technologies)檢測DNA樣品濃度。取200 ng檢測合格的DNA模板,根據Nimblegen SeqCap EZ Choice Library方法及流程進行Illumina文庫制備,使用 Agilent 2100對文庫的插入片段長度進行檢測,片段合格后再對文庫進行Q-PCR準確定量。在安諾優達基因科技有限公司Illumina HiSeq X Ten平臺進行候選基因靶向測序,通過FastQC工具對測序數據進行質控。使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)軟件將測序得到的序列與人類基因組參考序列hg19/GRCh37比對;過濾千人基因組(1000G; http://browser.1000genomes.org)、ExAC(http://exac.broadinstitute.org/)及gnomAD(http://www.gnomad-sg.org/)等多個人群數據庫和測序公司的本地數據庫的高頻變異,再經SIFT(http://provean.jcvi.org/seq_submit.php)、Polyphen2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)、CADD(http://cadd.gs.washington.edu/)等軟件進行致病性預測,通過ClinVar(https://www.ncbi.nlm.nih. gov/clinvar/)、OMIM(https://omim.org)和 HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)等疾病相關數據庫及文獻檢索變異是否被收錄,結合患者臨床表型、疾病遺傳模式、變異位點致病性等信息篩選候選變異位點。

1.2.3 候選致病變異的驗證

1.2.3.1 聚合酶鏈式反應(PCR)引物設計:在UCSC網站(http://genome.ucsc.edu/)獲得TSC1(NM_000368.4)和TSC2(NM_000548.3)的參考序列,應用Primer Primier3(http://primer3.ut.ee/)針對PS測序發現的候選致病變異設計PCR引物(表1),擴增區域涵蓋候選變異位點所在的外顯子及側翼序列。

表1 候選致病變異驗證PCR引物Table 1 PCR primers for validation of the candidate pathogenic variants

1.2.3.2 PCR反應及測序分析:通過PCR擴增先證者及家系成員候選變異所在的基因區域。PCR反應體系為25 μL,包含50 ng的基因組DNA,12.5 μL的2×GC buffer Ⅰ,4 μL的2.5 mmol/L的dNTP,上下游引物各1 μL(10 μmol/μL),0.25 μL LA Taq(5 U/μL)。擴增條件:95 ℃預變性3 min;35個循環:94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s;72 ℃延伸7 min。PCR產物送往諾賽基因組研究中心進行Sanger測序。測序結果經CodonCode Alingner軟件與參考序列比對以檢出變異。

1.2.4 變異致病性的分析:參考HGMD數據庫和相關文獻的研究結果,并依據美國醫學遺傳學與基因組學學會(The American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)指南對候選變異位點致病性進行判定。在HGMD中查詢檢出的變異,若變異已被HGMD收錄,則依據相關文獻所提供的致病性證據結合ACMG標準進行致病性再判定;若未被HGMD收錄,則依據ACMG指南所定義的證據鏈合并分析,如根據VarCards等分析軟件預測候選變異的致病性[6]、變異在千人基因組、ExAC及gnomAD等多個人群數據庫中的頻率、以及變異在家系中與疾病共分離情況等多個分級證據的合并分析結果,確定變異的致病性。

2 結果

2.1 患者臨床表現

來自5個家系的8例TSC患者均表現局灶性色素減退。2例先證者有家族史,其余3例為散發病例。5位先證者已在其就診醫院進行多項相關臨床檢查,結果顯示不同程度的多系統TSC特征病變(表2)。家系1先證者有色素脫失斑、癲癇、心臟功能異常,面部有血管纖維瘤(圖1A, B);家系2先證者患有癲癇和身體運動障礙,但其母親只有局部皮膚脫色斑和面部血管纖維瘤;家系3先證者有色素脫失斑、腎臟、中樞神經系統、心臟功能3方面異常;家系4先證者在多個器官,包括大腦、皮膚、心臟、肝臟、腎臟、肺和牙齦中均探測到錯構瘤(圖1C, D),并有嚴重的神經癥狀如癲癇、學習困難、行為等問題;家系5的先證者僅表現局部色素減退,CT檢測出其顱內結節鈣化但無神經層面表現。其父親及弟弟亦表現局部色素減退,但未作進一步臨床檢查。

表2 TSC先證者臨床表現Table 2 Clinical manifestation of the TSC probands

A.facial angiofibroma (family 1 proband, Ⅱ-1); B.depigmentation spots on skin (family 1 proband, Ⅱ-1); C.shagreen patch (family 4 proband, Ⅱ-1); D.odontogenic fibroma (family 4 proband, Ⅱ-1).

2.2 鑒定致病變異

在5個TSC家系中檢出致病變異,包括1個TSC1變異和4個TSC2變異(表3)。其中2個為新變異,包括一個無義變異TSC2:c.245G>A(Trp82*)(家系1)和一個移碼變異TSC2:c.235delG(Val79Lysfs27*)(家系2)(圖2,3)。其余3個為已報道致病變異,已收錄于HGMD數據庫,包括1個錯義變異TSC2:c.2 713C>T(Arg905Trp)(家系3)、一個移碼變異TSC2:c.826_827delAT(Met276Valfs60*)(家系4)和一個無義變異TSC1:c.2 074C>T(Arg692*)(家系5)。來自家系1、3和4的變異為新生變異。家系2和家系5為家族遺傳病例,變異和疾病呈現共分離。根據ACMG指南并考慮文獻提供的致病性判定依據進一步確認了3個已報道變異的致病性(表3)。2個新變異,c.245G>A(p.Trp82*)和c.235delG(p.Val79Lysfs27*),均可產生提前終止密碼子而導致所編碼蛋白質僅保留了N端不超過全長1/10長度的片段,突變點后多個重要的功能域缺失,喪失其正常功能(非常強致病性證據1,PVS1);在1 000G、ExAC及gnomAD等多個人群數據庫中未收錄(中等強度致病性證據2,PM2);文獻報道Trp82氨基酸位置其它核苷酸變異所導致的無義變異致病(強致病性證據1,PS1)[7]。合并上述分級證據判定這2個新變異為致病變異。

A.pathologic variant detected in TSC1; B.pathologic variants detected in TSC2.

表3 5個TSC家系變異致病性判定Table 3 Pathogenicity determination of the variants detected in 5 TSC families

3 討論

TSC1位于染色體的9q34,由21個外顯子組成,編碼Hamartin蛋白;TSC2定位于染色體16p13.3,包含41個外顯子,編碼Tuberin蛋白(圖3)。Hamartin和Tuberin通過它們位于N端區域附近的結構域相互作用[12],并與TBC1結構域家族成員7(TBC1D7)一起形成異三聚體復合物(又稱TSC蛋白復合物),是mTORC1信號的主要負調控因子。而Rheb作為小Ras相關的GTP酶, 在活性狀態下會激活mTORC1。Hamartin-tuberin復合物可以作為GAP(GTP酶激活蛋白)通過滅活Rheb來抑制mTOR通路[3]。TSC1或TSC2的致病變異破壞了其蛋白產物形成的功能復合物,導致了mTOR通路的過度激活、細胞周期調控異常和錯構瘤的形成。

文獻報道TSC2致病變異有比TSC1更高的頻率和更重的癥狀[3]。本研究結果與之類似,5個家系中4個為TSC2變異,且患者的表型均比TSC1變異的患者更為嚴重。由于TSC2編碼的Tuberin蛋白(1 807 AA)遠遠長于TSC1編碼的Hamartin蛋白(1 164 AA),也大大增加了TSC2突變的概率,無論是新生變異還是人群中累積的變異都以TSC2居多,故造成TSC2突變患者比TSC1突變患者有更高的比例。TSC1和TSC2編碼的Hamartin-Tuberin復合物通過Tuberin蛋白的GAP相關結構域催化Rheb上攜帶的GTP水解為GDP,從而使得Rheb失活而不能激活mTORC1的激酶活性。因此TSC2變異可能比TSC1變異對Hamartin-tuberin復合物的GAP活性具有更大的破壞性,導致mTOR途徑的更大失調[13-14]。本研究中發現的2個TSC2新變異:c.245G>A(Trp82*)和c.235delG(Val79Lysfs27*),可導致蛋白產物缺失下游約9/10的序列,其中包括Rap-GAP及其他重要的結構域(圖3)。由于與TSC1互作的區域存在于TSC2上游,有可能這2種缺乏正常功能的TSC2突變蛋白仍然能夠結合TSC1,從而導致突變Hamartin-Tuberin復合物缺乏正常功能并干擾了雜合子中正常Hamartin-Tuberin復合物的形成,但確切的致病機制需要更多的功能實驗來研究。

TSC1和TSC2的大多數變異由單堿基對缺失或插入和無義變異組成,導致蛋白質合成的過早終止或無義變異介導的mRNA降解。本研究中僅家系3為錯義突變TSC2:c.2 713C>T p.(Arg905Trp) ,多篇文獻已報道其為致病變異;此外,有研究者[15]通過對野生型和突變型TSC2蛋白的對比研究,發現該突變降低了Tuberin抑制S6K連接域磷酸化的能力。本研究中患者為新生突變,父母表型正常,進一步為該變異的致病性提供了證據。

本研究在5個TSC家系中檢出致病變異,包括2個TSC2新變異和3個已報道的致病變異,可為相關家庭的遺傳咨詢和產前診斷提供依據; 2個新變異的發現豐富了TSC2致病變異譜,有助于提高結節硬化癥的診斷率,并可能為疾病的精準治療提供新的靶點。