右美托咪定減輕呼吸機相關性肺損傷模型大鼠肺組織損傷

韓惠晶，吳 紅，葛 銀，喬 娟

江蘇省蘇北人民醫院 麻醉科，江蘇 揚州 225001

機械通氣在急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征等眾多危重疾病中是急救和呼吸治療的重要措施,也是全身麻醉常用的呼吸支持方法。然而過度機械通氣可加重已有的肺損傷甚至引起急性肺損傷,又稱為呼吸機相關性肺損傷(ventilator-associated lung injury, VILI)[1]。目前研究在肺保護性通氣方面取得一定的進展,但也造成其他器官的功能性障礙,尋找新的治療藥物至關重要[2]。研究顯示,RhoA/ROCK1信號通路參與了大鼠VILI的發生發展,抑制RhoA/ROCK1信號通路可以減輕大鼠肺損傷[3]。右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)具有抗炎作用,其治療可以減輕炎性反應,減輕呼吸機誘導的肺損傷[4]。但右美托咪定能否通過調控RhoA/ROCK1信號通路減輕VILI有待進一步驗證。本文主要探索右美托咪定對呼吸機誘導的肺損傷及RhoA/ROCK1信號通路的影響,以期為VILI的治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

成年SPF級雄性SD大鼠(200～250 g)[長沙市天勤生物公司,SCXK(湘)2019-0014)];右美托咪定(江蘇揚子江藥業);ROCK激活劑溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)(Sigma-Aldrich公司);HE染色試劑盒(上海懋康生物公司);TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒(上海碧云天生物公司);Bcl-2(Proteintech公司);Bax(CST公司);cleaved caspase-3、RhoA和ROCK1(Abcam公司);α-SMA(北京百奧萊博公司)。

1.2 方法

1.2.1 VILI模型構建與大鼠分組:所有大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉進行麻醉,經口氣管插管連接呼吸機,除對照組外所有大鼠以高潮氣量(high tidal volume,TV)22 mL/kg和零呼氣末正壓(zero positive end-expiratory pressure,PEEP)通氣,呼吸速率為16～18次/min;對照組大鼠以6 mL/kg的潮氣量和5 cm H2O的呼氣末正壓通氣,呼吸速率為45～55次/min[5]。每分通氣量(minute volume,MV)期間15 mg/kg·h-1戊巴比妥鈉維持麻醉,MV 4 h結束,將大鼠放回籠子,并提供食物和水。本實驗已經通過本院實驗動物倫理委員會批準。將所有大鼠分為對照組(control組)、模型組(VILI組)、右美托咪定(DEX)低、高劑量組(DEX-L、DEX-H組)[6]、右美托咪定高劑量+溶血磷脂酸(LPA)組(DEX-H+LPA組)[7]。DEX-L、DEX-H組:麻醉完大鼠,將留置針插入尾靜脈,MV前15 min分別尾靜脈注射1、10 μg/kg的DEX,期間分別尾靜脈注射1、10 μg/kg·h-1的維持劑量;DEX-H+LPA組:麻醉完大鼠,將留置針插入尾靜脈,MV前15 min尾靜脈注射10 μg/kg的DEX,期間尾靜脈注射10 μg/kg·h-1的維持劑量,另外在MV和DEX輸注前30 min腹腔注射40 μg/kg LPA。最終每組選取24只大鼠進行后續實驗。

1.2.2 ELISA檢測炎性因子:機械通氣結束后各組隨機選擇6只大鼠放血處死,低溫迅速取出右肺組織,結扎左主支氣管灌洗右肺,采集BALF,離心取上清,ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

1.2.3 肺組織濕/干質量比值的測定:隨機選取6只大鼠右肺組織清洗干凈,干凈紗布吸干水分后稱其質量即濕質量(W),烘干箱將其烘干稱其質量即為干質量(D),兩者比值即為W/D。

1.2.4 HE染色檢測肺組織損傷:從各組剩余大鼠中隨機選擇6只處死取右肺,4%多聚甲醛固定,乙醇脫水、透明、石蠟包埋、切片。HE染色后封片,顯微鏡觀察并對肺損傷進行評分。雙盲法根據肺泡毛細血管充血、出血、炎性細胞浸潤、肺泡壁厚度4項評分:0分,無損傷;1分,輕度損傷(病變范圍<25%);2分,中度損傷(病變范圍25%～50%);3分,重度損傷(病變范圍51%～75%);4分,極重度損傷(病變范圍>75%),肺損傷評分為四項指標分數相加[8]。

1.2.5 TUNEL染色檢測細胞凋亡:收集剩余6只大鼠右肺,冷凍切片,TUNEL染色,DAPI染核,具體操作參照TUNEL試劑盒實驗步驟,最后封片,熒光顯微鏡觀察,計算細胞凋亡率(綠色熒光為凋亡細胞)。

1.2.6 Western blot檢測蛋白質表達量:收集1.2.6剩余右肺組織,研磨并加入RIPA裂解液進行裂解,得到總蛋白質量,電泳、轉膜、封閉,加入Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、RhoA、ROCK1、α-SMA一抗,4 ℃冰箱孵育過夜,加入相應二抗,室溫孵育,隨后ECL孵育,凝膠電泳儀拍照分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 右美托咪定對各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響

與對照組相比,VILI組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05);與VILI組相比,DEX-L組、DEX-H組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平依次降低(P<0.05);與DEX-H組大鼠相比,DEX-H+LPA組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較Table 1 Levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in BALF of each group were

2.2 右美托咪定對各組大鼠肺組織W/D的影響

與對照組相比,VILI組大鼠W/D升高(P<0.05);與VILI組相比,DEX-L組、DEX-H組大鼠W/D依次降低(P<0.05);與DEX-H組大鼠相比,DEX-H+LPA組大鼠W/D升高(P<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠W/D比較Table 2 Comparison of W/D in each

2.3 右美托咪定對各組大鼠肺組織形態的影響

與對照組相比,VILI組大鼠肺組織結構異常,肺泡壁增厚,肺間質與肺泡間隙有大量炎性細胞浸潤,肺損傷嚴重,肺損傷評分升高(P<0.05);與VILI組相比,DEX-L組、DEX-H組大鼠肺組織結構趨于正常,肺泡壁厚度減少,炎性細胞浸潤量明顯減少,肺損傷減輕,肺損傷評分依次降低(P<0.05);與DEX-H組大鼠相比,DEX-H+LPA組大鼠肺組織結構遭到破壞,肺泡壁增厚,肺間質與肺泡間隙炎性細胞浸潤增多,肺損傷加重,肺損傷評分升高(P<0.05)(圖1,表3)。

Arrows indicated pathological injury of lung tissue.

表3 各組大鼠肺損傷評分

2.4 右美托咪定對各組大鼠肺組織細胞凋亡的影響

與對照組相比,VILI組大鼠肺組織TUNEL陽性細胞增多,細胞凋亡率、Bax、cleaved caspase-3表達升高,Bcl-2表達降低(P<0.05);與VILI組相比,DEX-L組、DEX-H組大鼠肺組織TUNEL陽性細胞依次減少,細胞凋亡率、Bax、cleaved caspase-3表達依次降低,Bcl-2表達依次升高(P<0.05);與DEX-H組大鼠相比,DEX-H+LPA組大鼠肺組織TUNEL陽性細胞增多,細胞凋亡率、Bax、cleaved caspase-3表達升高,Bcl-2表達降低(P<0.05)(圖2,3,表4)。

Arrows indtcated apoptosis.

表4 各組大鼠肺組織細胞凋亡比較

2.5 右美托咪定對各組大鼠RhoA/ROCK信號通路的影響

與對照組相比,VILI組大鼠RhoA、ROCK、α-SMA表達升高(P<0.05);與VILI組相比,DEX-L組、DEX-H組大鼠RhoA、ROCK、α-SMA表達依次降低P<0.05);與DEX-H組大鼠相比,DEX-H+LPA組大鼠RhoA、ROCK、α-SMA表達升高(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with VILI group; △P<0.05 compared with DEX-L group;▲P<0.05 compared with DEX-H group.

3 討論

VILI主要表現為肺泡-毛細血管屏障功能障礙,由于促炎因子大量釋放,導致炎性反應發生,水腫明顯[9]。右美托咪定作為一種新型腎上腺素能α2受體激動劑,廣泛應用于麻醉,具有鎮靜、鎮痛、抗感染、抗炎性反應抗凋亡等作用。其可以降低炎性反應,從而減輕大鼠的急性肺損傷[10]。本文研究顯示,右美托咪定可以減少肺組織炎性細胞浸潤,減少肺泡壁厚度,從而減輕肺損傷。

炎性反應在VILI的發生發展中至關重要,而TNF-α、IL-1β、IL-6作為重要的促炎因子細胞參與炎性反應及免疫應答,其水平高低可以用于判斷肺損傷嚴重程度。而肺組織W/D的變化可反映肺間質水腫改變的程度。目前已知TNF-α、IL-1β、IL-6參與肺損傷,降低其水平可以減輕炎性反應,改善肺損傷,保護大鼠VILI的肺臟[11]。另外VILI的發生可以誘導細胞凋亡顯著增加,從而破壞機體平衡。Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3參與細胞凋亡進程。其中下調Bax,上調Bcl-2,可以減少細胞凋亡,從而可減輕大鼠VILI[12]。本文研究顯示右美托咪定可以降低VILI大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、W/D、Bax、cleaved caspase-3表達水平,升高Bcl-2表達水平,提示右美托咪定可抑制炎性反應,減少細胞凋亡,改善肺損傷。

RhoA/ROCK信號通路參與細胞的各種生理和病理過程, 尤其在炎性反應和細胞凋亡過程中發揮重要作用。Rho蛋白是一種具有GTP酶活性的小分子鳥苷酸結合蛋白,RhoA是Rho家族成員之一,在哺乳動物的各種組織中廣泛表達[13]。活化的RhoA可以激活其下游靶蛋白ROCK,抑制胞質內肌動蛋白磷酸酶活性,促進α-SMA表達,進而影響細胞炎性及凋亡。研究顯示,抑制Rho/Rock信號通路,可降低肺組織內炎性反應,減少細胞凋亡,從而減輕肺損傷[14]。右美托咪定可以通過抑制 信號通路,提高Bcl-2/Bax比值,減少細胞凋亡[15]。本文研究顯示,右美托咪定可以降低RhoA、ROCK、α-SMA表達水平,減輕炎性反應,減少細胞凋亡,保護大鼠VILI。而RhoA激活劑可部分逆轉右美托咪定對大鼠肺損傷的保護作用,證實右美托咪定通過抑制RhoA/ROCK信號通路保護大鼠VILI。

綜上所述,右美托咪定通過抑制RhoA/ROCK信號通路保護大鼠VILI。本文仍存在局限性,右美托咪定作用于RhoA/ROCK信號通路的機制還尚不明確,需要進一步探討驗證。