桃葉珊瑚苷抑制人肝癌細胞系HepG2增殖

安 琪，齊光照，韓 超

鄭州大學第一附屬醫院 藥學部，河南 鄭州 450000

肝癌(liver cancer)是世界上第七大常見癌,也是第二大癌死亡原因[1]。肝癌細胞增殖迅速、易轉移,且有能力逃避免疫系統形成多重耐藥性,通常導致患者預后不良,因此尋找新型治療方法是改善當前問題的關鍵[2]。桃葉珊瑚苷(aucubin,AU)是一種廣泛存在于杜仲、桃葉等中藥材的活性物質,研究發現,AU能夠抑制異種移植肝細胞癌模型小鼠體內的腫瘤生長,同時增強了順鉑在模型小鼠中的抗腫瘤功效[3]。癌基因MDM2蛋白Ser183位點的蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)磷酸化可抑制抑癌基因TP53介導的衰老并促進活性氧(reactive oxygen species, ROS)誘導的腫瘤發生[4]。AU能否通過調節Akt/MDM2/p53信號通路影響肝癌的進展尚不清楚。因此,本研究將探究AU對肝癌細胞及細胞周期的影響,進而為臨床靶向治療肝癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系、裸鼠:人肝癌細胞系HepG2、SMMC-7721(武漢尚恩生物技術有限公司);BALB/c裸鼠(賽業生物科技有限公司)。

1.1.2 主要試劑:桃葉珊瑚花(aucubin,AU)(純度≥98%,成都瑞芬思德丹生物科技有限公司);Akt激動劑(SC79,上海澤葉生物科技有限公司);CCK-8法細胞增值檢測試劑盒[吉滿生物科技(上海)有限公司];細胞凋亡檢測試劑盒、p-Akt抗體、Ak抗體、p-MDM2抗體、MDM2抗體、p-p53抗體和p53抗體(Abcam公司);5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EDU)細胞增殖檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 篩選AU的給藥濃度及細胞的分組:復蘇HepG2細胞,無菌培養,取對數增殖期細胞進行后續實驗。將HepG2細胞接種于96孔板培養24 h;用Tris緩沖液配制濃度為0、0.1、0.5、2.5、12.5和62.5 mg/L的AU溶液,分別加入HepG2細胞中培養48 h;每孔細胞加入10 μL CCK-8工作液孵育1 h,輕微震蕩使細胞均勻分布,使用酶標儀檢測HepG2細胞的存活率。隨后將HepG2細胞分為4組:對照組(DMEM培養基培養)、AU低濃度組(AU L組,加入12.5 mg/L的AU溶液)、AU高濃度組(AU H組,加入62.5 mg/L的AU溶液)和AU H+SC79組(加入62.5 mg/L的AU溶液和1.8 mg/L的SC79)[5],置于無菌培養箱中培養48 h。

1.2.2 顯微鏡觀察細胞增殖狀態:使用倒置顯微鏡觀察各組HepG2細胞增殖狀態。

1.2.3 EDU法檢測細胞增殖:在各組HepG2細胞中加入50 μmol/L/孔EDU培養基,置于細胞培養箱中孵育2 h,清洗;室溫下使用多聚甲醛固定細胞10 min;加入2 mg/mL的甘氨酸孵育5 min,清洗;加入含0.5% TritonX-100的PBS溶液,搖床上孵育10 min,清洗;最后使用DAPI染液避光染色,顯微鏡下拍照并統計EDU陽性染色細胞比例。

1.2.4 流式細胞測量術檢測細胞凋亡:在各組細胞中加入胰蛋白酶,配制1×109個/L濃度的細胞懸液,向Falcon試管中加入100 μL細胞懸液,再加入annexin V-FTTC和PI工作液各5 μL,避光靜置15 min,加入結合緩沖液孵育1 h,使用流式細胞測量術檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 細胞周期的檢測:使用PBS清洗細胞3次,更換培養基培養48 h,離心,棄上清,剩余細胞加入PBS重懸,根據細胞周期檢測試劑盒要求,使用流式細胞術檢測細胞周期分布情況。

1.2.6 Western blot檢測p-Akt、Akt、p-MDM2、MDM2、p-p53、p53蛋白表達水平:提取各組細胞總蛋白質,定量后使用Western blot檢測蛋白質的表達。樣品上樣量10 μg,電泳參數:80 V,30 min,轉為120 V,1 h,轉膜參數:200 V,2 h。將封閉后的PVDF膜分別置于p-Akt、Akt、p-MDM2、MDM2、p-p53、p53和GAPDH一抗稀釋液中過夜,次日加入二抗稀釋液和ECL發光液,分析各蛋白的表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 不同濃度AU對HepG2細胞存活率的影響

隨著AU濃度的增加,HepG2細胞的存活率遞減,與0 mg/L AU組比較,12.5、62.5 mg/L AU組細胞的存活率顯著降低(P<0.05),后續選擇使用12.5、62.5 mg/L濃度的AU干預HepG2細胞(圖1)。

*P<0.05 compared with 0 mg/L.

2.2 各組HepG2細胞增殖狀態比較

對照組細胞單層貼壁增殖,密集成片,折光性好,大小均一;與對照組比較,AU L、H組懸浮細胞和脫落細胞逐漸增多,細胞皺縮變圓,絲狀偽足減少;與AU H組比較,AU H+SC79組細胞數量和絲狀偽足增加,脫落細胞減少,細胞皺縮情況顯著改善(圖2)。

圖2 各組HepG2細胞增殖狀態比較

2.3 各組HepG2細胞增殖比較

與對照組比較,AU L、H組EDU陽性染色細胞比例降低(P<0.05); 與AU H組比較, AU H+SC79組EDU陽性染色細胞比例升高(P<0.05)(圖3)。

A.EDU staining (×200); B.comparison of stained cell proportions (n=6, %);*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with AU H.

2.4 各組HepG2細胞凋亡率比較

與對照組比較,AU L、H組G0/G1期細胞降低,細胞凋亡率、S和G2/M期細胞升高(P<0.05);與AU H組比較,AU H+SC79組G0/G1期細胞升高,細胞凋亡率、S和G2/M期細胞降低(P<0.05)(圖4)。

2.5 各組HepG2細胞蛋白表達水平比較

與對照組比較,AU L、H組p-Akt/Akt、p-MDM2/MDM2蛋白表達水平下降,p-p53/p53蛋白表達水平升高(P<0.05);與AU H組比較,AU H+SC79組上述變化得到逆轉(P<0.05)(圖5)。

3 討論

肝癌是最具社會挑戰性的全球健康問題之一,其惡性程度高、進展快,治療后易復發,靶向抑制癌細胞活力是臨床上亟需突破的一大瓶頸[6]。AU是一種環烯醚萜苷,具有抗氧化、 抗炎、 抗癌等生物學作用[7]。本研究采用低、高兩種濃度的AU體外培養肝癌HepG2細胞,均發現細胞數量變少,細胞懸浮、脫落,說明AU不利于HepG2細胞的增殖。進一步檢測發現,AU能夠抑制HepG2細胞的增殖能力,促進凋亡,抑制肝癌移植瘤小鼠瘤組織的生長,說明AU具有抗肝癌的作用。

細胞周期是由生長因子啟動的信號通路,調控DNA復制、基因轉錄、蛋白質翻譯、翻譯后修飾等細胞事件的發生。真核生物的細胞周期由G0、G1、S2和M期組成。有研究證實,慢性肝病中肝細胞固有細胞周期相關激酶的異常激活通過免疫抑制重編程會破壞機體抗轉移免疫監視系統,會對癌的轉移產生影響[8]。在肝癌模型小鼠中,通過抑制細胞周期可以誘導抗腫瘤免疫反應,有效抑制腫瘤進展[9]。本研究發現,AU可以阻滯HepG2細胞周期,通過阻止G1停滯抑制癌細胞轉移,提示這可能是其引起細胞凋亡的一個因素。

Akt主要在代謝器官中表達,響應細胞應激、運動以及各種激素和藥物的刺激[10]。Akt激酶將細胞外信息轉遞到各細胞區室中,執行傳導細胞遷移、衰老、凋亡等使命,識別上下游因子在癌中發揮傳感器的作用[11]。Akt已經成為傳統癌治療、實體瘤免疫治療和分子靶向治療的主要預測標志物[12]。MDM2是一種公認的具有致癌潛力的分子,其多種促癌作用已被證實[13]。p53是一種腫瘤抑制因子,能夠激活MDM2,而MDM2誘導p53降解,二者形成一個負反饋環。當p53活性受到抑制時,受損細胞便不再發生細胞周期停滯或凋亡。通過直接結合MDM2或磷酸化修飾p53可以抑制癌細胞增殖,改善癌治療[14]。靶向調控Akt/MDM2/p53軸通過抑制細胞增殖和惡性侵襲以及促進細胞凋亡可以抑制肝癌的進展[15]。本研究發現,AU干預HepG2細胞后,p-Akt/Akt、p-MDM2/MDM2水平下降,p-p53/p53水平升高,提示AU可能通過調控Akt/MDM2/p53軸激活抑癌基因p53的表達,抑制HepG2細胞增殖。為了驗證這一推斷,本研究聯合使用Akt激活劑SC79與AU共同干預HepG2細胞,發現細胞增殖、凋亡、細胞周期以及Akt/MDM2/p53信號的表達沒有顯著變化,證實AU是通過調控Akt/MDM2/p53信號通路發揮對肝癌細胞生理活動的調節作用。

綜上所述,AU可能通過調控Akt/MDM2/p53信號通路抑制肝癌細胞增殖,誘導細胞周期阻滯與細胞凋亡。