抑制抗增殖蛋白2增強非小細胞肺癌細胞系A549對厄洛替尼敏感性

張 婧，楊自更，蔡文琴，曹維維，韋紅梅，薛茜茜，吳 賓*

新疆軍區總醫院 1.營養科；2.核醫學科；3.體檢中心，新疆 烏魯木齊 830000；4.大連康復療養中心 療養四科，遼寧 大連 116000

肺癌(lung cancer)是危害人類健康的重大疾病,具有高發病率和高病死率的特點[1-2]。非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌病例的85%以上,75%以上的患者首次就診時已經是肺癌晚期[3-4]。以吉非替尼(gefitinib,Gef)、厄洛替尼(erlotinib,Erl)等為代表的表皮生長因子酪氨酸酶抑制劑(epithelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)延長了攜帶EGFR突變的肺癌患者的總生存期,而EGFR-TKI耐藥嚴重限制了其治療成效[5-7]。因此,尋找有效的EGFR-TKI耐藥新靶點具有重要的意義。

抗增殖蛋白2(prohibitin 2,PHB2)屬于prohibitin家族成員,參與信號轉導、凋亡、炎性反應等多種細胞生物學過程[8]。研究顯示,與正常組織相比,PHB2高表達于多種類型的惡性腫瘤,被認為可能是預測腫瘤預后的獨立指標[9]。課題組前期研究發現,敲低PHB2可抑制NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲[10]。PHB2是線粒體自噬的重要線粒體膜受體之一[11],而靶向藥物耐藥與線粒體自噬密切相關[12],PHB2在靶向藥物耐藥中是否也發揮重要的作用尚不清楚。本研究主要探討PHB2在厄洛替尼繼發性耐藥中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

NSCLC細胞系A549、NCI-H1299細胞和PC-9細胞(中國科學院上海細胞庫);0.1%結晶紫溶液(西安赫特生物公司);CCK-8法細胞活性檢測試劑盒、5-乙炔基-2’-脫氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyurid-ine,EdU)細胞增殖檢測試劑盒、蛋白裂解液和JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(上海碧云天生物有限公司);線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅴ活性檢測試劑盒(美國索萊寶生物有限公司);Lipofectamine 2000(Invitrogen公司);RPMI 1640培養基、雙抗(青/鏈霉素混合液)和胎牛血清(BI公司);蛋白Marker(北京Applygen公司);TUNEL試劑盒、厄洛替尼(Roche公司);抗PHB2抗體(武漢三鷹生物技術有限公司);內參β-actin抗體和HRP標記的熒光二抗(CST公司);小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)(上海吉瑪生物技術有限公司);腺病毒綠色熒光蛋白-微管相關蛋白(green fluorescent protein-microtuble-associated protein light chain 3 alpha,GFP-LC3)(上海漢恒生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:將凍存NSCLC細胞系(A549、H1299和PC-9)迅速取出,在水浴鍋中震蕩凍存管,轉移到離心管中,離心,重懸,接種在新的培養瓶中,于5% CO2、37 ℃條件下常規培養,第2日換液。

1.2.2 實驗分組:觀察NSCLC細胞系對厄洛替尼(Erl)的敏感性,實驗分為6組,Erl濃度分別為0、1、2、3 、4和5 μmol/L;觀察厄洛替尼對線粒體自噬的影響實驗分為對照組(NC)和厄洛替尼(Erl)處理組(2 μmol/L);在A549細胞中轉染PHB2小干擾RNA(siPHB2),觀察PHB2在A549細胞對厄洛替尼敏感性中的作用,實驗分為對照組(siCtrl)、PHB2敲減組(siPHB2)、對照組+厄洛替尼處理組(siCtrl+Erl)和PHB2敲減+厄洛替尼處理組(siPHB2+Erl)。其中,siCtrl+Erl組和siPHB2+Erl組用濃度為2 μmol/L的厄洛替尼處理。

1.2.3 siPHB2轉染實驗:siPHB2由上海吉瑪公司合成。培養的細胞經常規消化,離心,重懸。將細胞濃度調整為1×104～1×105/mL,接種于24孔板。取一離心管,加入50 μL的無血清培養基和20 pmol/L的siRNA,混勻后放置5 min,標記為A液;在另一離心管中,同樣加入50 μL的無血清培養基和5 μL的Lipofectamine 2000,放置5 min,標記為B液?；旌螦液和B液,靜置20 min。將混合液共計105 μL加入到24孔板的每孔中,常規培養。

1.2.4 CCK-8法測定細胞活性:各組細胞常規消化離心,加入新鮮培養基重懸細胞。將各組細胞的濃度調整為1×105/mL,每孔加入100 μL的細胞懸液,接種于96孔培養板。用含10%的CCK-8試劑的新鮮基礎培養基替換原培養基,37 ℃下培養1 h,用酶標儀測各組在450 nm處的吸光度值(A450 nm)。

1.2.5 平板集落實驗測定集落形成能力:各組取對數生長期的細胞,胰蛋白酶常規消化,離心,重懸。將各組細胞的將濃度調整為1×103/mL。再往6孔板每個孔中加入200 μL的細胞懸液,搖晃鋪勻,常規培養。當孔中出現明顯的集落時,可以終止培養。每孔加入甲醇溶液1 mL固定,加入結晶紫染色液處理10 min。晾干,拍照,保存圖片用于進一步分析。

1.2.6 EdU染色測定細胞增殖:取對數生長期細胞,以每孔4×103/mL接種于共聚焦皿,常規培養。4%甲醛固定,配置和加入EdU工作液,孵育2 h。DAPI染液染核,共聚焦顯微鏡下觀察,拍照用于進一步分析。

1.2.7 TUNEL測定細胞凋亡:將各組細胞接種于共聚焦皿中,4%甲醛固定。加入通透液,作用10 min。配制和加入TUNEL工作液,避光,37 ℃的條件下孵育1 h。DAPI染核,常溫孵育5 min。用甘油封片,共聚焦顯微鏡觀察,拍照用于進一步分析。

1.2.8 Western blot測定蛋白質表達:收集各組細胞,加細胞裂解液提蛋白,BCA法蛋白定量。SDS-PAGE分離蛋白;轉膜,牛奶封閉,加一抗,孵育過夜,第2天加二抗孵育1 h,ECL發光,保存圖片用于后續分析。

1.2.9 比色法測定線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅴ活性:將各組細胞消化離心,下層細胞(細胞量約1×106個)勻漿破碎,渦旋混勻1 min。常規提取線粒體呼吸鏈復合體;配制工作液,按說明書步驟操作,比色法測定,繪制標準曲線,計算線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅴ活性。

1.2.10 細胞色素c含量檢測:按文獻[13]所述,消化離心收集各組細胞,常規分離胞質蛋白和線粒體蛋白,配制工作液,按照說明書測定細胞內胞質蛋白和線粒體蛋白細胞色素c含量。

1.2.11 MitoTracker染色和腺病毒綠色熒光蛋白-微管相關蛋白(green fluorescent protein-microtuble-associated protein light chain 3 alpha,GFP-LC3)轉染觀察線粒體和微管相關蛋白(microtuble-associated protein light chain 3 alpha,LC3)共定位:常規消化細胞,制備成單細胞懸液。細胞接種于共聚焦皿上,常規感染腺病毒GFP-LC3,配置MitoTracker染色液,避光,37 ℃的條件下孵育30 min。共聚焦顯微鏡觀察LC3表達、LC3線粒體共定位情況。

1.2.12 JC-1染色:使用JC-1染色檢測線粒體膜電位的變化。吸除共聚焦皿中培養液,用PBS緩沖液洗滌細胞。加入1 mL細胞培養液,然后加入1 mL JC-1染色工作液,充分混勻,細胞培養箱中孵育20 min。吸除細胞培養液,按照說明書配制適量的JC-1染色緩沖液,用JC-1染色緩沖液洗滌兩次。加入2 mL細胞培養液,激光共聚焦顯微鏡下觀察,拍照留存圖片并分析結果。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 NSCLC細胞系對厄洛替尼的敏感性

隨著厄洛替尼濃度梯度的增加,H1299細胞和PC-9細胞的活性呈濃度依賴性降低(P<0.05),在厄洛替尼5 μmol/L濃度范圍內,A549細胞的活性無明顯的改變(圖1)。

*P<0.05 compared with 0 μmol/L group.

2.2 厄洛替尼可增加A549細胞PHB2表達和線粒體自噬水平

與NC組相比,Erl組PHB2和LC3Ⅱ蛋白表達顯著增加(P<0.05),胞內LC3Ⅱ免疫熒光增加(P<0.05),LC3Ⅱ染色與線粒體染色共定位比率增加(P<0.05)(圖2)。

2.3 瞬轉siRNA敲低A549細胞內PHB2表達

與siCtrl組相比,siPHB2組PHB2表達顯著降低(P<0.05)(圖3)。

A, B.representative immunoblots and densitometric quantification for PHB2 and β-actin in A549 cells with PHB2 knockdown; *P<0.05 compared with siCtrl group.

2.4 敲低PHB2可增強厄洛替尼抑制A549細胞增殖的作用

與siCtrl組相比,siPHB2組EdU陽性的細胞數顯著減少(P<0.05);與siPHB2組和siCtrl+Erl組相比,siPHB2+Erl組EdU陽性的細胞數顯著減少(P<0.05);siCtrl組和siCtrl+Erl組之間EdU陽性的細胞數差異無統計學意義(圖4)。

A, B.representative images of the EdU assay and quantitative analysis of the EdU-positive cell ratio from the respective groups; *P<0.05 compared with siCtrl group; #P<0.05 compared with siPHB2 group; &P<0.05 compared with siCtrl+Erl group.

2.5 敲低PHB2可增強厄洛替尼抑制A549細胞集落形成能力的作用

與siCtrl組相比,siPHB2組集落形成數目顯著減少(P<0.05);與siPHB2組和siCtrl+Erl組相比,siPHB2+Erl組集落形成數目顯著減少(P<0.05);siCtrl組和siCtrl+Erl組之間集落形成數目差異無統計學意義(圖5)。

A, B.representative images and quantitation of colony formation of A549 cells from the respective groups; *P<0.05 compared with siCtrl group; #P<0.05 compared with siPHB2 group; &P<0.05 compared with siCtrl+Erl group.

2.6 敲低PHB2可增強厄洛替尼誘發的A549細胞凋亡

與siCtrl組相比,siPHB2組TUNEL陽性的細胞數顯著增加(P<0.05);與siPHB2組和siCtrl+Erl組相比,siPHB2+Erl組TUNEL陽性的細胞數顯著增加(P<0.05); 而siCtrl組和siCtrl+Erl組之間TUNEL陽性的細胞數差異無統計學意義(圖6)。

A, B.representative images of the TUNEL assay and quantitative analysis of the apoptotic index for A549 cells from the respective groups; *P<0.05 compared with siCtrl group; #P<0.05 compared with siPHB2 group; &P<0.05 compared with siCtrl+Erl group.

2.7 敲低PHB2可增強厄洛替尼誘發的線粒體功能受損

與siCtrl組相比,siPHB2組線粒體膜電位顯著降低(P<0.05),線粒體內細胞色素c減少(P<0.05),而細胞質內細胞色素c增加(P<0.05),線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅴ活性均顯著降低(均P<0.05);與siPHB2組和siCtrl+Erl組相比,siPHB2+Erl組線粒體膜電位顯著降低(P<0.05),線粒體內細胞色素c減少(P<0.05),而細胞質內細胞色素c增加(P<0.05),線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅴ活性均顯著降低(均P<0.05);siCtrl組和siCtrl+Erl組之間線粒體膜電位、線粒體和細胞質內細胞色素c變化、線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅴ活性的差異均無的統計學意義(圖7)。

A, B.representative images of JC-1 staining in A549 cells and the ratio of aggregated and monomeric JC-1 from the respective groups.C.levels of cytochrome c in cytosolic and mitochondrial fractions from the respective groups.D.complexⅠ/Ⅱ/Ⅴ activities in isolated mitochondria; *P<0.05 compared with siCtrl group; #P<0.05 compared with siPHB2 group; &P<0.05 compared with siCtrl+Erl group.

3 討論

越來越多的證據顯示,PHB2作為一種重要的骨架蛋白,與腫瘤的增殖、凋亡、遷移和侵襲密切相關[9]。課題組前期研究[10]發現,PHB2表達與NSCLC腫瘤分化、淋巴結轉移和臨床分期具有相關性; PHB2可與RACK1結合并調控RACK1穩定性及表達,進而促進腫瘤進展。同時,敲低PHB2促進A549細胞凋亡[14]。本研究發現,敲低PHB2使得EdU染色陽性的增殖細胞數目顯著減少,平板集落數目減少;敲低PHB2可誘導A549細胞凋亡和線粒體功能受損,線粒體途徑的細胞凋亡也可能是抑制PHB2引發細胞活性下降的重要機制。

有研究顯示,使用一代EGFR-TKI的同時,聯用自噬抑制劑,對EGFR-TKI耐藥的NSCLC細胞系具有很好協同殺傷作用[15]。研究顯示,PHB2可以作為一種重要的線粒體膜受體參與LC3識別受損的線粒體的過程[11],而抑制PHB2介導的線粒體自噬能否改善對EGFR-TKI耐藥尚不清楚。本研究發現,與NC組相比,Erl組PHB2和LC3Ⅱ蛋白表達顯著增加,且LC3Ⅱ染色與線粒體染色共定位比率增加,表明厄洛替尼處理可能增加了PHB2介導的線粒體自噬水平。此外,采用siRNA敲低PHB2后發現,與siPHB2組和siCtrl+Erl組相比,siPHB2+Erl組細胞增殖能力顯著降低,細胞凋亡顯著增加,線粒體細胞線粒體活性顯著降低,表明敲低PHB2可顯著增強厄洛替尼抑制A549細胞增殖和促進線粒體途徑細胞凋亡的能力。

綜上所述,本研究發現敲低PHB2可改善A549細胞對厄洛替尼的敏感性,其機制可能與其抑制PHB2介導的線粒體自噬有關,為PHB2用于改善一代EGFR-TKI耐藥提供了一定的實驗依據。