帕立骨化醇抑制氧化應激減輕小鼠肝細胞緊密連接受損

張威威，謝 婧，李麗華

1.沈陽醫學院 病理生理教研室，遼寧 沈陽 110034；2.臺州學院 醫學院 基礎教研室，浙江 臺州 318000

氧化應激是酒精性肝病、非酒精性肝病、纖維增殖性肝病[1]、膽汁淤積性肝病[2]等多種肝臟疾病中肝損傷的病理生理基礎,活性氧(reactive oxygen species,ROS)主要通過細胞色素酶P450在線粒體及肝細胞的內質網中產生[1]。研究表明,過度暴露于氧化應激會導致血液-膽道屏障功能障礙[3],并通過破壞肝細胞之間的緊密連接使得膽汁淤積在膽小管內,引發嚴重的膽汁淤積性肝損傷[4]。各種ROS引起的氧化應激,是導致不同組織中上皮和內皮屏障功能破壞的主要因素之一[5]。此外,研究發現在膽汁淤積性肝病動物模型中,肝細胞緊密連接的結構和功能會發生改變[6]。因此,抑制氧化應激來穩定肝細胞緊密連接可能是治療膽汁淤積性肝損傷的有效手段。

帕立骨化醇(paricalcitol,Pal)是一種維生素D類似物,在肝臟代謝成活性形式的維生素D,是一種選擇性維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)的激動劑。維生素D受體在人體中起到多種重要的生理功能,包括維持骨骼健康、調節免疫系統和抗炎作用等。研究表明,VDR缺乏會損害膽管完整性,從而加劇膽汁淤積性肝損傷[7]。此外,帕立骨化醇可通過減少氧化應激和增加肝臟中的抗氧化物質來減輕肝臟損傷,也可能通過影響肝臟細胞的功能來降低損傷[7-8]。但帕立骨化醇是否可以調控肝細胞緊密連接及其機制過程,皆尚不清楚。本研究通過膽管結扎建立膽汁淤積小鼠模型及用H2O2誘導HepG2細胞構建細胞氧化應激損傷模型探討帕立骨化醇對肝細胞緊密連接的作用,闡明其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:SPF級C57BL/6小鼠45只,8～10周齡,體質量為(25±2)g,由常州卡文斯試驗動物公司提供,動物生產許可證號:SCXK(蘇)2021-0013。

1.1.2 細胞系:人肝癌細胞系HepG2(上海賽百慷生物有限公司)。

1.1.3 試劑:丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)(南京建成生物工程研究所);總膽汁酸(total bile acid,TBA)、總膽紅素(total bilirubin,TBIL)劑盒(華美生物工程研究所);8-氧代鳥嘌呤DNA糖基化酶1(8-oxoguanine DNA-glycosylase 1,OGG1)抗體、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NOX1)抗體、ZO-1和occludin抗體、β-肌動蛋白抗體、ERK抗體、p-ERK抗體、HRP標記羊抗兔二抗和HRP標記羊抗鼠二抗(Proteintech公司);NF-κB、p65(Abcam公司);熒光二抗(Invitrogen公司);二氫乙啶(DHE)試劑盒(Beyotime公司);帕立骨化醇(particalcitol,Pal)(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物模型制備和分組:將45只8～10周雄性C57BL/6小鼠隨機分為對照組(control)、模型組(膽管結扎,bile duct ligation,BDL)、治療組(BDL+Pal),每組15只。對照組小鼠不行結扎手術,僅繞膽總管穿線。模型組、治療組小鼠行膽總管雙重結扎手術并切斷。治療組小鼠膽總管結扎后腹腔注射200 ng/kg帕立骨化醇,間隔1 d給藥,持續5 d;模型組注射等量鹽溶液。末次給藥24 h后,各組小鼠經眼球取血,斷髓,取肝臟。

1.2.2 檢測各組小鼠肝損傷指標:各組小鼠眼眶取血,靜置1 h后,2 000 r/min、4 ℃離心20 min。取血清后用試劑盒對各組小鼠血清ALT、AST活性進行檢測,單位為U/L。酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒測定血清和肝臟中的TBA濃度和TBIL水平,單位為μmol/L。

1.2.3 HE染色檢測各組小鼠肝組織病理形態表現:取4%多聚甲醛固定后的肝組織,石蠟包埋、切片后進行HE染色。染色后在光學顯微鏡下可觀察各組小鼠肝組織病理形態表現。

1.2.4 抗氧化狀態的生化分析:使用MDA試劑盒測量肝組織丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)水平,使用SOD試劑盒測量超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平。將肝組織(0.1 g)加入到0.9 mL 0.9%氯化鈉溶液中,制成10%均質肝組織混合物。收集肝組織勻漿的上清液。然后通過酶標儀在562 nm處測定吸光度,以確定總蛋白質濃度。對于MDA水平測量,將100 μL 1%總蛋白質上清液與2 mL工作緩沖液混合,并在40 ℃下孵育95 min。將反應混合物用流水冷卻后進行4 000 rpm離心10 min。在532 nm處對上清液的吸光度進行檢測?？瞻讓φ諡?00%乙醇,標準對照為10 nmol/L對照品溶液。對于SOD,將20 μL 10%總蛋白質與220 μL工作溶液混合,并在37 ℃下孵育20 min,而后在450 nm處記錄吸光度值。

1.2.5 細胞培養與處理:HepG2細胞放置在DMEM培養基中,并在37 ℃、5% CO2條件下傳代培養。取對數生長期的細胞用于后續實驗。為了誘導氧化應激,將細胞置于孔板后,H2O2(400 μmol/L)處理24 h,治療組為H2O2(400 μmol/L)與Pal(20 nmol/L)共孵育24 h。收集細胞置于-80 ℃用于后續蛋白質印跡分析,細胞爬片用于免疫染色。

1.2.6 細胞內活性氧的測定:通過DHE試劑盒對ROS水平加以檢測。DHE熒光染色液滴加在細胞上并置于37 ℃培養箱中孵育30 min。ROS水平表現為在熒光顯微鏡下觀察的紅色熒光強度。顯微鏡下拍照后進行統計分析。

1.2.7 蛋白質印跡分析:將各組肝組織超聲裂解后取上清,進行BCA定量。30 μg蛋白質行SDS-PAGE后,90 V、95 min條件下進行轉膜,然后使用2% BSA于37 ℃烘箱封閉2 h。一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次,每次15 min。二抗室溫孵育2 h,TBST洗膜后ECL顯影曝光。使用Image J軟件對目的蛋白質條帶進行分析,計算目的蛋白質表達水平。目的蛋白質表達水平=目的蛋白質條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Pal減輕小鼠膽汁淤積性肝損傷

與對照組比較,模型組小鼠血清中AST和ALT水平顯著升高(P<0.05或P<0.01),提示BDL小鼠肝損傷程度增加;TBA和TBIL水平顯著升高(P<0.05),提示BDL小鼠膽汁淤積造模成功。與模型組比較,Pal治療組小鼠血清中AST和ALT活性、TBA和TBIL水平顯著降低(P<0.05),提示Pal減輕BDL小鼠的膽汁淤積性肝損傷(圖1)。

BDL.bile duct ligation;Pal.paricalcitol;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;#P<0.05 compared with BDL group.

2.2 Pal改善膽汁淤積小鼠肝組織的病理形態結構

對照組小鼠肝細胞形態完整,未見炎性細胞浸潤及肝細胞壞死。模型組肝細胞壞死區面積較大,且炎性細胞浸潤程度嚴重。而Pal治療組小鼠顯著改善小鼠膽汁淤積性肝損傷,較模型組相比,可見炎性細胞浸潤減輕,肝細胞壞死區面積減少(圖2)。

BDL.bile duct ligation;Pal.paricalcitol;The red arrow points to the necrotic area;Green arrows point to areas of inflammatory cell infiltration.

2.3 Pal降低膽汁淤積小鼠肝臟的氧化應激水平

與對照組比較,模型組小鼠肝臟中MDA活性及OGG1、NOX1的蛋白表達水平顯著升高(P<0.05或P<0.01),SOD活性顯著降低(P<0.01),表明模型組小鼠肝臟氧化應激水平顯著提高。而Pal治療可顯著減輕小鼠肝臟氧化應激水平,MDA、OGG1、NOX1水平較模型組均顯著降低(P<0.05或P<0.01),而SOD活性顯著升高(P<0.05)(圖3)。

2.4 Pal降低H2O2處理的HepG2細胞中的ROS水平

與對照組比較,模型組HepG2細胞中DHE染色陽性區增多,提示氧化應激水平升高。與模型組相比,治療組HepG2細胞中陽性區顯著減少(P<0.05),提示Pal可降低氧化應激水平(圖4)。

DHE.dihydroethidium;Pal.paricalcitol;#P<0.05 compared with BDL group.

2.5 Pal改善氧化應激誘導的HepG2細胞緊密連接受損

相比于對照組,ZO-1和occludin的蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),提示氧化應激誘導HepG2細胞緊密連接受損。然而Pal治療可有效抑制細胞緊密連接受損,可見與模型組相比,ZO-1和occludin的蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)(圖5)。

BDL.bile duct ligation;Pal.paricalcitol;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with BDL group.

2.6 Pal改善膽汁淤積小鼠肝臟細胞緊密連接受損

相比于對照組,模型組小鼠肝臟中ZO-1和occludin的蛋白表達水平降低(P<0.05),提示膽汁淤積小鼠肝臟細胞緊密連接受損。相比于模型組,Pal治療組小鼠肝臟中ZO-1和occludin的蛋白表達水平顯著升高(P<0.05或P<0.01),這表明Pal能夠有效改善膽汁淤積小鼠肝臟細胞緊密連接受損(圖6)。

BDL.bile duct ligation;Pal.paricalcitol;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05,##P<0.01 compared with BDL group.

2.7 Pal可能通過抑制NF-κB/p65和ERK信號通路,減輕膽汁淤積小鼠肝臟細胞緊密連接受損

相比于對照組,模型組小鼠肝臟組織中p-p65、p-ERK蛋白表達水平顯著增加(P<0.05或P<0.01),這表明信號通路激活;MLCK、p-MLC水平顯著上調,提示細胞緊密連接開放。相對于模型組,Pal治療顯著抑制小鼠肝臟中p-p65、p-ERK、MLCK、p-MLC水平(P<0.05或P<0.01),提示Pal可能通過抑制NF-κB/p65和ERK信號通路,減輕細胞緊密連接受損(圖7)。

2.8 Pal可能通過抑制NF-κB/p65和ERK信號通路,減輕氧化應激誘導的HepG2細胞緊密連接受損

與對照組比較, 模型組HepG2細胞中p-p65、p-ERK、MLCK、p-MLC的蛋白表達水平顯著升高(P<0.05或P<0.01或P<0.001或P<0.001)。與模型組比較,Pal治療組小鼠肝臟中p-p65、p-ERK、MLCK、p-MLC水平顯著降低(P<0.05),提示Pal可能通過抑制NF-κB/p65和ERK信號通路,減輕氧化應激誘導的HepG2細胞緊密連接受損(圖8)。

BDL.bile duct ligation;Pal.paricalcitol;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001 compared with control group;#P<0.05 compared with BDL group.

3 討論

膽汁淤積繼發引起的各種肝臟疾病統稱為膽汁淤積性肝病,它是一種常見的肝膽疾病,常伴有有害膽汁酸(bile acid,BA)積聚,從而導致肝膽損傷。膽汁淤積性肝損傷的發病機制非常復雜,氧化應激是主要的誘因之一。膽汁淤積過程中產生有毒的高水平BA,進而引起線粒體功能障礙,誘導細胞凋亡和氧化應激。此外,氧化應激也是參與膽汁淤積向肝纖維化及肝功能衰竭進展的必要因素。

在多種膽汁淤積性肝損傷動物模型中,可見肝細胞緊密連接受損。眾所周知,氧化應激可破壞上皮的緊密連接,導致緊密連接蛋白解離,并使得緊密連接蛋白與細胞骨架失去聯系[9]。在膽汁淤積性肝損傷期間,肝細胞緊密連接遭到破壞,使得膽小管因內容物外流至肝細胞間隙而喪失有利于膽汁分泌的滲透壓,加劇肝損傷[10]。

Pal是一種VDR激動劑,具有抗炎、抗氧化應激、抗纖維化等諸多優點。Pal可通過多種信號機制抑制氧化應激,從而對肝臟、腎臟起到保護作用[11-12],但Pal對細胞緊密連接的影響,尚不清楚。本研究通過H2O2處理HepG2細胞構建氧化應激模型,通過對小鼠膽總管結扎(BDL)構建膽汁淤積模型,給予Pal治療,結果提示Pal可減輕小鼠膽汁淤積性肝損傷,并可通過降低肝細胞氧化應激來維持肝細胞緊密連接穩定。

肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light-chain kinase,MLCK)是調節緊密連接的主要物質[13]。MLCK依賴性肌球蛋白Ⅱ調節輕鏈(MLC)的磷酸化是緊密連接生理功能調節的重要中間體。在多種腸道疾病中,MLCK使得MLC磷酸化后破壞細胞緊密連接從而引發腸上皮屏障受損,破壞腸道功能[13-14]。ERK是經典的氧化應激相關信號通路,NFκB是經典的炎癥相關信號通路。研究發現,ERK以及NFκB都可通過增加MLCK轉錄來促進緊密連接開放[15]。本研究結果提示帕立骨化醇可能通過抑制ERK和NFκB信號通路來穩定肝細胞緊密連接,從而緩解小鼠膽汁淤積性肝損傷。

綜上所述,帕立骨化醇通過抑制膽汁淤積性小鼠及肝細胞系中的氧化應激并減輕肝細胞緊密連接受損,其潛在分子機制可能與抑制活性氧及NF-κB/p65、ERK信號通路有關。