迷迭香酸對子癇前期大鼠炎癥和內皮功能障礙的影響

張 媛,魯 楊,彭迎春,劉穎燕,章樂霞,楊 洋(樂山市人民醫院婦產科,樂山 64000;西安市人民醫院,西安市第四醫院生殖醫學中心;通訊作者,E-mail:yangyang9840056@63.com)

子癇前期(preeclampsia,PE)是一種妊娠期特有的妊娠期高血壓合并癥,是導致孕產婦和圍產兒死亡、早產和胎兒生長受限的主要原因,其發病機制復雜,目前缺乏有效的治療方法[1,2]。PE的發生發展與炎癥反應過度激活和氧化應激產物水平增加有關,抗炎和抗氧化在PE治療中起重要作用[3]。血管內皮功能障礙是PE發病的中心環節[4,5]。正常情況下,細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和白細胞功能相關抗原(leukocyte function-related antigen-1,LFA-1)的表達水平較低,無法使內皮黏附中性粒細胞[6]。然而,腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、白細胞介素-1(interleukin-1,IL)和單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP)等促炎細胞因子的增加可激活PE患者血管內皮和白細胞上的黏附分子配體,從而上調ICAM-1、VCAM-1和LFA-1的水平,導致內皮細胞與中性粒細胞黏附并誘導內皮損傷[7]。因此,改善內皮功能障礙是治療PE的有效途徑。迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)是一種來自唇形科植物的水溶性天然酚酸類化合物,如迷迭香、鼠尾草、羅勒等。RA具有多種藥理活性,包括抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等[8,9]。研究表明,RA通過降低內皮素-1和血管緊張素轉換酶活性以及增加一氧化氮水平來降低果糖誘導的高血壓[10]。RA通過調節磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖轉運蛋白4的表達來改善鏈脲佐菌素誘導的1型糖尿病或高脂飲食誘導的2型糖尿病大鼠的高血糖和胰島素敏感性[11]。然而,目前尚無文獻報道RA在PE中的應用效果。本研究通過觀察RA對PE大鼠收縮壓、24 h尿蛋白、胎鼠體質量和死亡率、PE大鼠胎盤和腎臟組織形態、血清氧化應激指標、血清炎癥細胞因子、胎盤黏附因子、胎盤TLR4信號通路的影響,探討RA治療PE大鼠模型的效果,及其對炎癥和內皮功能障礙的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑 迷迭香酸(R4033)購自美國Sigma公司;L-NAME(ST1555-10g),蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(C0105M)、過碘酸雪夫(PAS)染色試劑盒(C0142M)、RIPA裂解液(P0013C),BCA試劑盒(P0012S)、BeyoECL Plus(P0018S)購自上海碧云天生物技術公司;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(A001-3-2)、丙二醛(MDA)試劑盒(A003-1-2)購自南京建成生物工程研究所;IL-1β ELISA試劑盒(ER1094)、IL-6 ELISA試劑盒(ER0042)、IFN-γ ELISA試劑盒(ER0012)、MCP-1 ELISA試劑盒(ER0047)購自武漢菲恩生物科技有限公司;ICAM-1(ab171123)、LFA-1(ab52895)、VCAM-1(ab174279)、Toll樣受體4(TLR4)(ab217274);髓樣分化因子88(MyD88)(ab2064)、GAPDH(ab181602)一抗和山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab6721)二抗購自美國Abcam公司。

1.1.2 實驗儀器 ZS-Z無創尾動脈血壓測量分析系統(北京眾實迪創科技發展有限責任公司);ZH-B6大鼠代謝籠(安徽正華生物儀器設備有限公司);7600-020型全自動生化分析儀(日本日立公司)。

1.1.3 實驗動物 7～8周齡SPF級成年Sprague-Dawley(SD)大鼠(雄性:體質量270～310 g;雌性:體質量210～240 g)購自西安交通大學實驗動物中心,生產許可證SCXK(陜)2020-001。所有大鼠均不限制食物和水,并在(22±3)℃、(60±3)%濕度和12 h光暗循環的環境中飼養。將大鼠按照雌雄2∶1比例同籠飼養,觀察到雌鼠陰道中精子并有陰栓脫落為孕第0天。本研究大鼠實驗操作遵循實驗動物福利倫理審查指南標準執行,經過西安市人民醫院倫理委員會審查通過(審批號202203161703)。

1.2 方法

1.2.1 PE大鼠建模 參考文獻[12]方法建立PE大鼠模型。孕第11天開始,對大鼠連續4 d每天皮下注射1 mL的左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME,200 mg/kg),孕第15天測量收縮壓(SBP),SBP升高30 mmHg以上表示建模成功。

1.2.2 大鼠分組及處理 孕第15天時,將30只成功建模的大鼠隨機分為3組:模型組、50RA組和100RA組,每組10只;另取10只同期孕鼠作為對照組。孕第15天時,對照組和模型組大鼠每天灌胃1 mL的0.9%氯化鈉溶液,50RA組和100RA組大鼠分別給予1 mL的劑量為50 mg/kg和100 mg/kg的RA治療處理,各組大鼠均連續灌胃7 d處理。參考文獻[13,14]設定RA的使用劑量。

1.2.3 SBP的測定 孕第21天時,應用無創尾動脈血壓測量分析系統測量各組大鼠收縮壓(systolic blood pressure,SBP)。

1.2.4 24 h尿蛋白的測定 孕第21天時,使用ZH-B6大鼠代謝籠收集尿液,將大鼠尿液離心(4 ℃,2 000 r/min,15 min)取上清。通過全自動生化分析儀測定24 h尿蛋白。

1.2.5 胎鼠體質量和死亡率的測定 孕第21天時,用2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉孕鼠,剖宮取出胎鼠,統計各組胎鼠體質量和死亡率。

1.2.6 胎盤和腎臟組織學染色 孕第21天時,分離大鼠胎盤和腎臟,組織標本在4%多聚甲醛中固定48 h,石蠟包埋,切成4 μm厚切片。按照試劑盒說明,胎盤組織進行HE染色,腎臟組織進行PAS染色。

1.2.7 血清SOD和MDA的檢測 孕第21天時,大鼠眼眶靜脈叢采血0.5 mL,離心(4 ℃,3 000 r/min,15 min)取血清。按照試劑盒說明檢測大鼠血清SOD和MDA水平。

1.2.8 血清炎性細胞因子的檢測 孕第21天時,使用ELISA試劑盒檢測大鼠血清中炎性細胞因子IL-1β、IL-6、IFN-γ和MCP-1的水平。

1.2.9 Western blot檢測ICAM-1、LFA-1、VCAM-1、TLR4和MyD88蛋白表達水平 使用RIPA裂解緩沖液提取大鼠胎盤組織勻漿中的總蛋白,并使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白質(45 μg/泳道)通過10%的SDS-PAGE分離并轉移到聚偏二氟乙烯膜上。在與抗ICAM-1(1∶1 000)、LFA-1(1∶2 000)、VCAM-1(1∶1 000)、TLR4(1∶2 000)、MyD88(1∶2 000)一抗在4 ℃過夜孵育。隨后,將膜與山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1∶2 000)二抗在室溫下孵育2 h。使用BeyoECL Plus顯色,并使用Image J軟件分析光密度。GAPDH(1∶2 000)作為內參蛋白。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 RA對PE大鼠SBP和24 h尿蛋白的影響

孕第21天時,與對照組相比,模型組大鼠SBP和24 h尿蛋白水平均升高(P<0.05);與模型組相比,50RA組和100RA組大鼠的SBP和24 h尿蛋白水平均降低(P<0.05,見表1)。

表1 RA對孕21 d PE大鼠SBP和24 h尿蛋白水平的影響Table 1 Effects of RA on SBP and 24 h urine protein le-vels in PE rats at the 21st day of pregnancy

2.2 RA對胎鼠體質量和死亡率的影響

與對照組相比,模型組胎鼠體質量降低(P<0.05);與模型組相比,50RA組和100RA組胎鼠體質量均升高(P<0.05,見表2)。與對照組相比,模型組胎鼠死亡率升高(4.92%vs29.82%,P<0.05);與模型組相比,50RA組和100RA組胎鼠死亡率均降低(29.82%vs17.46%,13.33%,P<0.05);各組間胎鼠死亡率差異有統計學意義(χ2=9.928,P=0.019,見表2)。

表2 RA對胎鼠體質量和死亡率的影響Table 2 Effects of RA on body weight and mortality of fetal rats

2.3 RA對PE大鼠胎盤和腎臟組織形態的影響

孕第21天時,胎盤組織HE染色顯示,對照組大鼠胎盤血運豐富,形態正常;模型組大鼠胎盤絨毛數量減少,結構異常,壞死;50RA組和100RA組大鼠的胎盤形態較模型組明顯改善(見圖1)。孕第21天時,腎臟組織PAS染色顯示,對照組大鼠腎小球形態正常,結構完整;模型組大鼠腎小球肥大,邊界不清晰,腎小球系膜基質堆積,腎小球基底膜增厚;50RA組和100RA組的大鼠腎臟形態較模型組明顯改善(見圖1)。

圖1 RA對孕21 d PE大鼠胎盤和腎臟組織形態的影響 (×400)Figure 1 Effects of RA on placenta and kidney morphology of PE rats at pregant day 21 (×400)

2.4 RA對PE大鼠血清氧化應激指標的影響

各組大鼠孕第21天時血清SOD和MDA水平差異有統計學意義(P<0.001)。與對照組相比,模型組的血清SOD水平降低,MDA升高(P<0.05);與模型組相比,50RA組和100RA組的血清SOD水平均升高,MDA均降低(P<0.05,見圖2)。

注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與50RA組比較,&P<0.05。圖2 RA對孕21 d PE大鼠血清SOD和MDA水平的影響Figure 2 Effect of RA on serum SOD and MDA levels in PE rats at pregant day 21

2.5 RA對PE大鼠血清炎癥細胞因子的影響

孕第21天時,與對照組相比,模型組大鼠的血清IL-1β、IL-6、IFN-γ和MCP-1水平均升高(P<0.05);與模型組相比,50RA組和100RA組大鼠的血清IL-1β、IL-6、IFN-γ和MCP-1水平均降低(P<0.05,見圖3)。

注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與50RA組比較,&P<0.05。圖3 RA對孕21 d PE大鼠血清IL-1β、IL-6、IFN-γ和MCP-1水平的影響Figure 3 Effect of RA on serum IL-1β, IL-6, IFN-γ and MCP-1 levels in PE rats at pregant day 21

2.6 RA對PE大鼠胎盤黏附因子的影響

孕第21天時,與對照組相比,模型組大鼠胎盤組織中ICAM-1、LFA-1和VCAM-1的蛋白表達水平均升高(P<0.05);與模型組相比,50RA組和100RA組大鼠胎盤組織中ICAM-1、LFA-1和VCAM-1的蛋白表達水平均降低(P<0.05,見圖4)。

注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與50RA組比較,&P<0.05。圖4 Western blot檢測RA對孕21 d PE大鼠胎盤組織中ICAM-1、LFA-1和VCAM-1的蛋白表達水平的影響Figure 4 Effect of RA on protein expression levels of ICAM-1, LFA-1 and VCAM-1 in placental tissue of PE rats at pregant day 21 by Western blot

2.7 RA對PE大鼠胎盤TLR4信號通路的影響

孕第21天時,與對照組相比,模型組大鼠胎盤組織中TLR4和MyD88的蛋白表達水平均升高(P<0.05);與模型組相比,50RA組和100RA組大鼠胎盤組織中TLR4和MyD88的蛋白表達水平均降低(P<0.05,見圖5)。

注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與50RA組比較,&P<0.05。圖5 Western blot檢測RA對孕21 d PE大鼠胎盤組織中TLR4和MyD88的蛋白表達水平的影響Figure 5 Effect of RA on protein expression levels of TLR4 and MyD88 in placental tissue of PE rats at pregant day 21 by Western blot

3 討論

氧化應激、炎癥、免疫和血管內皮功能障礙已經成為治療PE的創新靶點[15]。探索靶向這些異常途徑的新藥物可能會產生更有效的治療效果。目前有許多預防和治療PE的候選藥物正在研究中,包括質子泵抑制劑[16]、二甲雙胍[17]、他汀類藥物[18]、白藜蘆醇[19]、褪黑素[20]等,然而,這些藥物大多數具有副作用。阻礙PE新藥研發的一個重要問題是新藥對母嬰的安全性。RA是一種天然酚酸類化合物,目前廣泛用于食品和化妝品行業,具有良好的安全性[21]。此外,RA具有降壓、降糖、抗糖尿病等作用[10,11]。本研究推測RA可能是治療PE的高安全性潛在藥物,因此,本研究首次探索了RA治療PE大鼠模型的效果。L-NAME誘導PE大鼠模型是一種誘導實驗性高血壓的方法,其病情類似于臨床PE。本研究結果表明,50 mg/kg和100 mg/kg的RA均降低了PE大鼠SBP和24 h尿蛋白水平,提高了胎鼠體質量,降低了胎鼠死亡率,改善了胎盤和腎臟組織形態,這些結果說明RA在治療PE方面具有較高的潛力。

氧化應激和炎癥是PE發生發展的關鍵因素,PE發展過程中的低氧環境可以促使過多的活性氧、炎癥因子釋放到母體循環中[22],損傷胎盤內皮,引起內皮功能障礙[23]。大量研究證實,抗氧化酶SOD在PE患者中降低[24],而脂質氧化代謝物MDA升高[25]。IL-1β、IL-6、IFN-γ和MCP-1是參與PE胎盤炎癥的主要因子[26,27]。本研究表明,50 mg/kg和100 mg/kg的RA均抑制了PE大鼠的氧化應激和炎癥,表現為血清SOD水平升高,MDA降低,以及血清IL-1β、IL-6、IFN-γ和MCP-1水平降低。因此,RA的抗氧化和抗炎作用可能是治療PE的主要機制。內皮調節血管擴張能力,內皮功能障礙表現為血管的收縮和舒張動態平衡功能被破壞,從而引起高血壓,這是PE的主要臨床特征[28]。血管收縮增強損害了腦、心、肝和腎等主要器官的血液供應,在腎臟中主要表現為尿蛋白排泄增加,稱為蛋白尿[29]。黏附因子(如ICAM-1、LFA-1和VCAM-1)與內皮功能障礙密切相關,黏附因子的大量分泌可導致內皮細胞與中性粒細胞黏附并誘導內皮損傷[6,7]。本研究表明,50 mg/kg和100 mg/kg的RA均抑制了PE大鼠胎盤組織中ICAM-1、LFA-1和VCAM-1的蛋白表達,表明RA可能通過減少胎盤組織的黏附因子來減輕PE大鼠的內皮功能障礙。目前,其他學者也報道了RA對內皮功能的保護作用。例如,RA通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路減輕過氧化氫引起的大鼠主動脈環內皮功能障礙[30];RA可減輕糖尿病引起的大鼠主動脈血管功能障礙[13]。因此,RA治療PE的機制與其內皮功能保護作用有密切關聯。

TLR4信號通路在人類各種疾病病理損傷中發揮重要作用[31]。MyD88是重要的細胞內銜接蛋白,可作為TLR4信號級聯的效應器,MyD88的激活可促進炎癥[32]。TLR4信號通路也是參與PE形成的重要通路[33]。TLR4信號通路不僅參與炎癥和氧化應激的調控,而且其過度激活也會損傷內皮功能[34]。目前,大量學者認為TLR4信號通路是治療PE的重要靶標[35,36]。本研究表明,50 mg/kg和100 mg/kg的RA均抑制了PE大鼠胎盤組織中TLR4和MyD88的蛋白表達,從而抑制了TLR4信號通路的激活。其他文獻已經報道了RA對TLR4及其下游信號分子表達的抑制作用[37,38]。因此,本研究認為RA可能通過減輕TLR4信號通路介導的炎癥、氧化應激和內皮功能障礙來發揮其對PE的治療作用。

綜上所述,本研究表明RA有效減輕了PE大鼠的臨床癥狀,RA可能通過減輕TLR4信號通路介導的炎癥、氧化應激和內皮功能障礙來發揮其對PE的治療作用。因此,RA作為治療PE的新型天然藥物,可能具有較高的開發價值。