HPLC法同時(shí)測(cè)定羌活藥材中甲基托布津和辛硫磷農(nóng)藥的殘留

周瑞雪,連云嵐,郝云芳,馮 貞,李民生,張遠(yuǎn)芳,李 倩,崔廣青(山西省檢驗(yàn)檢測(cè)中心藥品檢驗(yàn)技術(shù)研究所生物制品室,太原 03000;山西省檢驗(yàn)檢測(cè)中心藥品檢驗(yàn)技術(shù)研究所中藥室;通訊作者,E-mail:450889749@qq.com)

農(nóng)藥殘留(pesticide residues)指使用農(nóng)藥后一個(gè)時(shí)期內(nèi)沒(méi)被分解而殘留在生物體、收獲物、水體、環(huán)境和空氣中微量的農(nóng)藥原體、有毒的代謝物以及雜質(zhì)的總稱。農(nóng)藥對(duì)農(nóng)林收獲物和空氣、水、土壤等的污染,大多源于農(nóng)藥的利用率偏低以及農(nóng)藥的施用不合理[1]。如何合理、高效地施用農(nóng)藥,提升農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全,同時(shí)不斷開發(fā)靈敏、快速、高效的農(nóng)殘檢測(cè)技術(shù),對(duì)保障人體健康、改善農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量及減少環(huán)境污染具有重要意義[2]。

目前應(yīng)用于農(nóng)藥檢測(cè)的前處理方法很多,其中常用的有:液液萃取法、固相萃取法、固相微萃取法和分散液相萃取法等[3-5]。苯并咪唑類農(nóng)藥儀器分析主要集中在多菌靈(即辛硫磷)和噻菌靈的同時(shí)檢測(cè)分析,而同時(shí)測(cè)定農(nóng)產(chǎn)品中多菌靈和甲基托布津種苯并咪唑類農(nóng)藥的方法僅在國(guó)外文獻(xiàn)中有部分報(bào)道[6]。同時(shí)檢測(cè)羌活藥材中常見(jiàn)的這兩種農(nóng)藥甲基托布津和辛硫磷,未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。震蕩法具有提取效率高、操作方便等優(yōu)點(diǎn),因此本試驗(yàn)采用震蕩提取結(jié)合高效液相色譜法來(lái)對(duì)羌活樣品中的辛硫磷和甲基托布津進(jìn)行提取分析,旨在建立一種操作簡(jiǎn)單、易于推廣應(yīng)用、并可滿足羌活藥材中辛硫磷和甲基托布津殘留量同時(shí)測(cè)定的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

Agilent 1260高效液相色譜儀購(gòu)自安捷倫科技公司,CM-1000型高速振蕩機(jī)購(gòu)自上海愛(ài)朗儀器有限公司,乙腈(色譜純)和甲酸(分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

甲基托布津標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/L),購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所;辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/L),購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。

收集的羌活藥材及飲片為國(guó)家藥品監(jiān)督管理局組織的全國(guó)評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)專項(xiàng)任務(wù)樣品,分別來(lái)自于四川、安徽等藥材生產(chǎn)基地和全國(guó)批發(fā)零售企業(yè)等地的抽樣,樣品共計(jì)202批次,取適量進(jìn)行粉碎,分別過(guò)四號(hào)篩,即為所需羌活藥材粉末。

1.2 溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 將甲基托布津和辛硫磷用乙腈分別配制成甲基托布津0.67 mg/mL、辛硫磷0.20 mg/mL的母液,置于-20 ℃冷凍保存。臨用現(xiàn)配,稀釋成約20 μg/mL的溶液。

1.2.2 液相色譜條件 硅膠柱C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈與0.1%甲酸(含10 mmol/L甲酸銨)(70∶30),柱溫30 ℃,流速為0.8 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm,進(jìn)樣量10 μL。

1.2.3 供試品溶液制備 取羌活藥材粉末約3 g,加入氯化鈉約5 g,精密加入10 mL含0.1%甲酸的乙腈溶液,置于100 mL具塞量筒中,避光操作,猛烈振搖150次,放置1 min,再振搖100次,靜置1 h,經(jīng)過(guò)0.25 g無(wú)水硫酸鈉及0.45 μm濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液即得。

1.3 樣品前處理因素的篩選

1.3.1 樣品前處理提取溶劑的選擇 參照文獻(xiàn)[7],本研究分別對(duì)乙酸乙酯、乙腈及0.1%甲酸的乙腈溶液幾種提取溶劑進(jìn)行了考察。

1.3.2 樣品前處理提取方法的選擇 參照文獻(xiàn)[7,8],分別對(duì)這兩種提取方法進(jìn)行考察:渦旋1.5 min后靜置1 h;或樣品加氯化鈉共同振搖2遍,每遍100次左右,然后靜置1 h,用無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾。

1.3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別對(duì)甲基托布津和辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全波長(zhǎng)光譜掃描,選擇最優(yōu)檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 線性關(guān)系及檢出限的考察 取約20 μg/mL的甲基托布津及辛硫磷對(duì)照溶液,分別按照1,2,4,6,8,10 μL進(jìn)樣,按上述1.2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,計(jì)算此兩種農(nóng)藥的對(duì)照溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 方法精密度及回收率試驗(yàn) 取約3 g羌活藥材粉末,分別添加不同體積的甲基托布津和辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,制得不同濃度的回收率待測(cè)樣品,按照供試品溶液制備方法對(duì)樣品進(jìn)行提取及凈化,通過(guò)外標(biāo)法定量的方法,計(jì)算出各自相應(yīng)的平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 甲基托布津和辛硫磷皆對(duì)光和熱比較敏感,所以對(duì)兩者的穩(wěn)定性進(jìn)行了相關(guān)的試驗(yàn)。將此二者標(biāo)準(zhǔn)溶液分別放在棕色進(jìn)樣瓶中,置于液相儀器進(jìn)樣盤上,無(wú)光進(jìn)入,在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)環(huán)境中,在16 h內(nèi)連續(xù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品變化情況,考察穩(wěn)定性。

1.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

檢測(cè)全國(guó)產(chǎn)地及藥材市場(chǎng)收集的202批次羌活藥材中甲基托布津和辛硫磷兩種農(nóng)藥殘留的含量,按1.2.3供試品溶液制備方法進(jìn)行處理,每個(gè)供試品處理2份平行樣,按1.2.2液相色譜條件檢測(cè),采集譜圖峰面積。根據(jù)峰面積計(jì)算含量。

2 結(jié)果

2.1 樣品前處理提取溶劑的選擇

經(jīng)對(duì)樣品前處理提取液進(jìn)行考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用0.1%甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑時(shí),目標(biāo)物回收率有較明顯提高(見(jiàn)表1),因此選擇使用含0.1%甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑。

表1 樣品前處理提取溶劑的選擇Table 1 Selection of extraction solvents for sample pretreatment

2.2 樣品前處理提取方法的選擇

對(duì)羌活藥材粉末前處理提取方法考察結(jié)果顯示,藥材粉末加入0.1%甲酸的乙腈溶液進(jìn)行渦旋1.5 min后靜置1 h提取,甲基托布津和辛硫磷回收率分別為71.55%和65.01%;羌活藥材粉末加0.1%甲酸的乙腈和氯化鈉共同振搖2次,每次100次左右,然后靜置1 h,用無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾的提取方法,回收率分別為101.33%和88.59%。第二種方法回收率更高,因此作為供試品前處理提取方法。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

經(jīng)對(duì)甲基托布津和辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全波長(zhǎng)光譜掃描,光譜圖顯示分別在267 nm和283 nm處有最大吸收峰(見(jiàn)圖1),參考文獻(xiàn)[9,10]并綜合考慮,因此選用280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 甲基托布津和辛硫磷全波長(zhǎng)掃描光譜圖Figure 1 Full-wavelength scanning spectrogram of thiophanate-methyl and phoxim

2.4 線性關(guān)系及檢出限的考察

建立甲基托布津和辛硫磷這兩種農(nóng)藥的對(duì)照溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中可以看出甲基托布津和辛硫磷這兩種農(nóng)藥的線性相關(guān)性較好,R2均大于0.995,按照信噪比即S/N=3得到該方法對(duì)甲基托布津和辛硫磷的儀器檢測(cè)限分別為4 ng/mL和3 ng/mL,可以滿足目前國(guó)內(nèi)對(duì)蔬菜水果樣品的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)0.05 mg/kg的檢測(cè)要求。

表2 兩種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線方法線性方程、線性相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Standard curve linear equation, linear correlation coefficient and detection limit for two pesticides

2.5 方法精密度及回收率試驗(yàn)

通過(guò)外標(biāo)法定量的方法,計(jì)算甲基托布津和辛硫磷各自相應(yīng)的平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。從表3中的測(cè)定結(jié)果可以看出,甲基托布津和辛硫磷在不同添加量時(shí)的回收率均較高,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值較低,重現(xiàn)性也比較理想。甲基托布津的回收率為92.14%～112.56%,辛硫磷的回收率為87.85%～103.45%。

表3 兩種農(nóng)藥成分回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of recovery rate and precision test of the two pesticides

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取羌活藥材粉末,按1.2.3供試品溶液制備方法進(jìn)行處理,得供試品溶液,2～8 ℃放置,分別于1,2,3,6,8,12,16 h上樣檢測(cè),采用1.2.2液相色譜條件檢測(cè),采集譜圖峰面積。結(jié)果顯示,16 h以內(nèi)的峰面積的RSD分別為0.45%和1.02%,表明溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 樣品農(nóng)藥殘留含量檢測(cè)結(jié)果

對(duì)202批次羌活藥材樣品進(jìn)行檢測(cè),測(cè)出疑似辛硫磷樣品為36批次,含量范圍為10.18～87.73 μg/g;甲基托布津樣品為15批次,含量范圍為0.19～1.66 μg/g其中兩者均檢出的有3批次,甲基托布津和辛硫磷對(duì)照品液相色譜圖及羌活藥材樣品液相色譜圖,并將相應(yīng)峰進(jìn)行光譜確認(rèn),結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 羌活藥材陽(yáng)性供試品液相色譜圖和光譜圖Figure 2 Liquid chromatogram and spectrum of Notopterygium incisum positive sample

3 討論

甲基托布津和辛硫磷為羌活藥材種植中常用的農(nóng)藥,對(duì)人體有一定的毒性,使用過(guò)程中難免會(huì)有殘留,但目前尚未見(jiàn)到羌活藥材常用的農(nóng)藥殘留相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。甲基托布津和辛硫磷2種成分對(duì)溫度和光較敏感,尤其見(jiàn)光易分解,所以對(duì)羌活藥材樣品前處理過(guò)程中要注意避光操作。本文建立的檢測(cè)方法,使用氯化鈉粉末和無(wú)水硫酸鈉粉末進(jìn)行兩步除雜凈化,不需要昂貴的凈化小柱,檢測(cè)成本較低,更經(jīng)濟(jì),且前處理操作簡(jiǎn)單,方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均較高。故本文建立的方法有較好的使用價(jià)值,適合大范圍推廣,能滿足羌活藥材農(nóng)藥殘留的定量檢測(cè)要求,可用于羌活藥材中常用農(nóng)藥甲基托布津和辛硫磷的殘留檢測(cè)。