阿奇霉素干混懸劑微生物限度檢查方法選擇原則

閔 紅 張秉華 閆 博 劉 宇 戴 涌▲

1.陜西省食品藥品檢驗研究院，陜西西安 710065；2.陜西省綏德縣市場監(jiān)管綜合執(zhí)法大隊，陜西綏德 718099

阿奇霉素干混懸液為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，主要通過干擾、破壞微生物蛋白質(zhì)的合成達到殺菌、消炎的目的。抗生素類藥物一般具有較強抑菌性[1-2]，可共存的微生物往往處于受損狀態(tài)。若采用常規(guī)法進行微生物檢驗，受損微生物在抑菌劑的影響下無法正常繁殖，會造成“假陰性”結(jié)果。但該藥進入人體后，受損微生物從有抑菌性轉(zhuǎn)入無抑菌性的環(huán)境，會逐漸復(fù)蘇并正常繁殖，從而對人類健康造成危害[3]。

《中華人民共和國藥典》中方法均經(jīng)過驗證，每種藥物在引入檢驗之前，應(yīng)先進行微生物方法適用性研究[4]。微生物適用性研究的本質(zhì)是去除藥物的抑菌性，具體方法包括稀釋法、中和法、薄膜過濾法，即稀釋液/培養(yǎng)基體積的增加、適宜的中和劑篩選、薄膜沖洗量的提高等[5-7]。

本研究考察常規(guī)法、稀釋法、中和法、稀釋結(jié)合中和法、薄膜過濾結(jié)合中和法等13種方法去除阿奇霉素干混懸劑抑菌性的能力，比較稀釋結(jié)合中和法和稀釋、薄膜過濾結(jié)合中和法的優(yōu)、劣勢，以期為企業(yè)提出相應(yīng)的指導(dǎo)意見。

1 儀器與材料

1.1 儀器、耗材

試驗用儀器、耗材：法國梅里埃有限公司生產(chǎn)的VITEK2全自動微生物鑒定系統(tǒng)；上海力申科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的HFsafe-1200 LC型生物安全柜；上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的LRH-250B型生化培養(yǎng)箱；浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的FC752型薄膜過濾器、HTY-ASL0i型集菌儀；德國賽多利斯公司生產(chǎn)的BS2202S型電子分析天平。

1.2 供試品

阿奇霉素干混懸劑（西安利君制藥有限公司，批號：2006291）。

1.3 菌種

具體菌種信息見表1。

表1 菌種信息

1.4 試劑及培養(yǎng)基

以下試劑、培養(yǎng)基均由北京陸橋技術(shù)有限公司生產(chǎn)。稀釋液為pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液；選用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液（聚山梨酯80含量為10%）作為含中和劑的稀釋液；0.1%蛋白胨溶液（聚山梨酯80含量為0.1%）作為沖洗液；培養(yǎng)基種類主要有胰酪大豆胨液體（soybeancasein digest broth，TSB）培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂（soybean-casein digest agar，TSA）培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體（sabouraud dextrose broth，SDB）培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂（sabouraud dextrose agar，SDA）培養(yǎng)基。

2 方法

2.1 菌液制備

菌液制備條件見表2。

表2 菌液制備條件

2.2 微生物限度方法適用性試驗

2.2.1 常規(guī)法（1∶10供試液） 1∶10供試液制備：稱取10 g阿奇霉素干混懸劑，加入pH 7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液中，定容至100 ml。

試驗組：量取10.0 ml的1∶10供試液裝于無菌試管中，加入5種代表性的試驗菌液0.1 ml，其含菌量不超過104cfu/ml，革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、芽孢菌群、霉菌、酵母菌的代表分別為金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉、白色念珠菌[3]。取1 ml制備好的試驗組，置于直徑90 mm的培養(yǎng)皿中，注入TSA培養(yǎng)基（在35℃下培養(yǎng)3 d）或SDA培養(yǎng)基（在25℃下培養(yǎng)5 d），培養(yǎng)完成后計數(shù)。

菌液對照組：將供試液用pH 7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液替代，詳細操作同試驗組[5-7]。

供試品對照組：將菌液用pH 7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液替代，詳細操作同試驗組[5-7]。

供試品回收值R1為：試驗組N與供試品對照組的菌落數(shù)N0之差，比菌液對照組菌落數(shù)N1，即R1=（N-N0）/N1。

若供試品的需氧菌總數(shù)的回收值（5種試驗菌）、霉菌和酵母菌總數(shù)的回收值（2種試驗菌）均在0.5～2.0，則其方法適用性試驗通過[5-7]。每種試驗菌均需進行3次重復(fù)試驗。

2.2.2 中和法 供試液制備：稱取10 g阿奇霉素干混懸劑，采用pH 7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液（聚山梨酯80含量為10%）定容至100 ml，配制成1∶10的供試液。

除需設(shè)置試驗組、菌液對照組、供試品對照組外，還需增加中和劑對照組，即將供試品用相應(yīng)量中和劑的稀釋液替代，具體操作同試驗組[5-7]。其余操作同“2.2.1常規(guī)法”。

根據(jù)公式R1=（N-N0）/N1計算供試品回收值，根據(jù)公式R2=N2/N1計算供試品回收值。其中R2、N1、N2分別為中和劑回收值、菌液對照組菌落數(shù)、中和劑對照組菌落數(shù)。

2.2.3 稀釋結(jié)合中和法 供試液制備：取阿奇霉素干混懸劑10 g，以pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液（聚山梨酯80含量為10%）為稀釋液，分別制成1∶20、1∶50、1∶100、1∶200和1∶500供試液。

試驗組：分別取上述制備好的5種供試液30 ml裝于無菌試管中，試驗平行3次，再分別加入0.3 ml含菌量≤104cfu/ml的試驗菌液，3種試驗菌分別是金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌。

取制備好的試驗組1 ml，分別置于5個培養(yǎng)皿（直徑為90 mm和150 mm）中，平均每皿0.2 ml，注入TSA（35℃培養(yǎng)3 d）或SDA（25℃培養(yǎng)5 d），計數(shù)。菌液對照組、供試品對照組、中和劑對照組分別采用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液（聚山梨酯80含量為10%）代替供試液、菌液、供試品，具體操作與試驗組相同。回收值的計算同“2.2.2中和法”。

2.2.4 薄膜過濾結(jié)合中和法 供試液、試驗組、菌液對照組、供試品對照組和中和劑對照組制備同“2.2.2中和法”。

過濾培養(yǎng)：分別取上述制備好5種樣品1 ml，加入50 ml的pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，在薄膜過濾器中過濾，再用100 ml的0.1%蛋白胨溶液（聚山梨酯80含量為0.1%）沖洗，重復(fù)沖洗5次，將濾膜正面朝上貼于TSA上，然后進行培養(yǎng)、計數(shù)。回收值計算同“2.2.2中和法”。

2.2.5 稀釋、薄膜過濾結(jié)合中和法 供試液制備：取阿奇霉素干混懸劑10 g，以pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液（聚山梨酯80含量為10%）為稀釋液，分別制成1∶20和1∶100供試液。其余過程均同“2.2.4薄膜過濾法結(jié)合中和法”。

3 結(jié)果

3.1 采用常規(guī)法、中和法開展需氧菌總數(shù)方法適用性研究

對阿奇霉素干混懸劑采用常規(guī)法、中和法開展需氧菌總數(shù)方法適用性研究（表3），發(fā)現(xiàn)黑曲霉和白色念珠菌的回收值均在0.5～2.0范圍，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的回收值均為0。

表3 采用常規(guī)法、中和法開展方法研究的回收值

對阿奇霉素干混懸劑采用常規(guī)法開展霉菌和酵母菌總數(shù)方法適用性研究（表4），發(fā)現(xiàn)白色念珠菌和黑曲霉的回收值均在0.5～2.0范圍，可取1∶10供試液（以pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液）1 ml傾注平皿（直徑90 mm）進行該供試品的霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。

表4 采用常規(guī)法開展霉菌和酵母菌總數(shù)方法研究的回收值

若使用中和劑就應(yīng)確認該中和劑對微生物無毒性，即中和劑回收值在0.5～2.0范圍內(nèi)，才可用于該供試品的方法適用性試驗[5-7]。10%聚山梨酯80對微生物無抑制作用，可用于阿奇霉素干混懸劑微生物方法適用性試驗。

3.2 采用稀釋結(jié)合中和法開展需氧菌總數(shù)方法適用性研究

對阿奇霉素干混懸劑采用稀釋結(jié)合中和法進行需氧菌總數(shù)方法適用性研究（表5），當(dāng)取1∶500供試液1 ml傾注至直徑150 mm的無菌平皿，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的回收值在0.5～2.0范圍內(nèi)，其余方法回收值均不能達到要求。因此，可取1∶500供試液（以聚山梨酯80含量為10%的pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液為稀釋液）1 ml平均傾注5個無菌平皿中進行該供試品的需氧菌總數(shù)計數(shù)。

表5 采用稀釋結(jié)合中和法開展方法研究的回收值

3.3 采用稀釋、薄膜過濾結(jié)合中和法開展需氧菌總數(shù)方法適用性研究

對阿奇霉素干混懸劑采用稀釋、薄膜過濾結(jié)合中和法，開展需氧菌總數(shù)方法適用性研究（表6），當(dāng)取1 ml的1∶100供試液進行薄膜過濾時，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的回收值均在0.5～2.0范圍內(nèi)。因此，可取供試品10 g，以pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液（聚山梨酯80含量為10%）為稀釋液，制成1∶100供試液。用無菌注射器取該供試液1 ml加入薄膜過濾器中（50 ml的 pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液），用0.1%蛋白胨溶液（聚山梨酯80含量為0.1%）沖洗，分5次沖洗，每次沖洗100 ml，然后進行該供試品的需氧菌總數(shù)計數(shù)。

表6 采用稀釋、薄膜過濾結(jié)合中和法開展方法研究的回收值

4 討論

微生物方法學(xué)研究需綜合考慮藥物的劑型、處方、標準限度等，為藥物探索出污染風(fēng)險低、靈敏度高、操作性強、成本低廉的微生物檢查法，滿足企業(yè)常態(tài)化的檢驗[8]。

4.1 中和法消除藥物制劑抑菌活性

在藥品微生物檢測過程中，添加中和劑到稀釋劑、沖洗液或培養(yǎng)基中，可顯著鈍化、中和其藥物的抑菌活性[9]。聚山梨酯80是一種非離子型表面活性劑，在供試品制備過程中主要起乳化和增溶作用[9-11]，是《中華人民共和國藥典》規(guī)定的常用中和劑。有研究在pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液（常規(guī)稀釋液）中添加了10%聚山梨酯80，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的回收值均為0，表明單獨使用聚山梨酯80作為中和劑，無法消除阿奇霉素干混懸劑的抑菌性，與稀釋法或薄膜過濾法結(jié)合使用能更好地發(fā)揮作用[10]。

4.2 稀釋結(jié)合中和法消除藥物制劑抑菌活性

稀釋法通過對抑菌成分的稀釋減弱藥品的抑菌活性[12]。本研究首先增加了稀釋液體積，分別采用1∶20、1∶100、1∶200、1∶500供試液1 ml傾注直徑為90 mm的無菌平皿，其次將直徑150 mm取代90 mm的培養(yǎng)皿，并將1 ml供試液平均分為5皿進行傾注，將培養(yǎng)基總量增加到400 ml。如果回收值仍無法達到《中華人民共和國藥典》要求，可將1 ml供試液平均分配到更多平皿進行傾注，達到增加培養(yǎng)基量的目的。

4.3 稀釋、薄膜過濾結(jié)合中和法消除藥物制劑抑菌活性

薄膜過濾法是將供試品通過孔徑≤0.45 μm的濾膜，藥品成分被過濾，微生物被截留于濾膜，常被用于強抑菌性藥品的檢測[5，12]。本研究首先采用薄膜過濾結(jié)合中和法，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的回收值均為0。然后采用了1∶100稀釋結(jié)合薄膜過濾和中和法，5種試驗菌的回收值達到0.5～2.0范圍。目前，市場中薄膜過濾器的質(zhì)量參差不齊，并且無法精準對每個試驗用薄膜過濾器進行質(zhì)控，因此，中、美、歐藥典均規(guī)定總沖洗量不超過500 ml[5-7]。由于薄膜過濾法對沖洗量的限制，將稀釋法、中和法結(jié)合薄膜過濾法，能有效去除抗生素類藥物的抑菌性[13]。

4.4 根據(jù)需求選擇更準確可靠的微生物檢驗方法

微生物限度檢查直接影響藥品使用的安全性[14]。平皿法操作方便，不易污染，成本低；薄膜過濾法操作繁瑣，易受污染，對人員技術(shù)性要求高，需要配制集菌儀和薄膜過濾器[11]，試驗成本較高。從成本、操作、污染風(fēng)險方面，對阿奇霉素干混懸劑檢驗應(yīng)首選稀釋法結(jié)合中和法；從檢驗靈敏度方面應(yīng)首選稀釋結(jié)合薄膜過濾結(jié)合中和法。

無論平皿法還是薄膜過濾法都存在檢驗耗時長、不能使產(chǎn)品快速放行、增加儲存成本問題，快速微生物檢測技術(shù)可提高檢測效率和自動化程度，并為藥品微生物檢驗的數(shù)據(jù)可靠性提供新思路[15]。