醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑補(bǔ)腎生精片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

陳宗文 陳燕顏 盧偉寧 江洪亮

廣東省高州市中醫(yī)院制劑科，廣東高州 525200

補(bǔ)腎生精片為潘茂名弟子傳承下來的醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑注冊品種（批準(zhǔn)文號：粵藥制字Z05170158），具有超過20年的臨床應(yīng)用歷史。本品具補(bǔ)腎壯陽，生精之功效，用于男子精子數(shù)少、活動(dòng)力或活動(dòng)率差、死精等，已經(jīng)為廣大不育男性患者帶來福音，值得進(jìn)一步完善其理論體系及市場化開發(fā)利用。原該制劑的注冊標(biāo)準(zhǔn)只有黃芪、山茱萸的薄層鑒別以及山藥的顯微鑒別，已經(jīng)不能滿足本品市場化的需求及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高的要求。本研究參照《制劑質(zhì)量研究及標(biāo)準(zhǔn)制定指導(dǎo)原則》，對該注冊制劑品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升進(jìn)行研究，為本品市場化及實(shí)際生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與材料

JJ124BF型電子分析天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；SB25-12DTD超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；RIGOL L-3000型高效液相色譜儀（北京普源精電科技有限公司）；Rigol Compass C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；WFH-201BJ型紫外可見透射反射儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；薄層層析用硅膠G、硅膠GF254（青島海洋化工廠分廠）。

1.2 試藥與試劑

補(bǔ)腎生精片（批號：20210812、20210908、20211006）及各陰性樣品均由高州市中醫(yī)院制劑室提供；淫羊藿苷（批號：110737-201516）、熟地黃對照藥材（批號：121196-201406）、巴戟天對照藥材（批號：121163-201405）均購于中國藥品生物制品檢定所；試劑：流動(dòng)相為色譜純，其余為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 淫羊藿[1-2]取本品細(xì)粉6 g，加70%乙醇溶液50 ml，玻璃棒攪拌下溶解，超聲30 min，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)尤?0 ml熱水，玻璃棒攪拌下溶解，置分液漏斗以水飽和正丁醇振蕩提取3次，30 ml/次，合并正丁醇液，再以氨水振蕩洗滌3次，30 ml/次，下層濃氨試液棄去，上層正丁醇液置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)尤? ml乙醇使溶解，制成淫羊藿供試品溶液。再稱取缺淫羊藿陰性樣品細(xì)粉6 g，自“置三角燒瓶中，加70%乙醇溶液50 ml，玻璃棒攪拌下溶解，超聲30 min”起制成陰性對照溶液。另取淫羊藿苷適量，加甲醇定容并超聲溶解，制成0.135 mg/ml對照品溶液。按薄層層析法，于同一硅膠G薄層板上分別點(diǎn)樣對照品、供試品及陰性對照溶液8、1、1 μl，以乙酸乙酯∶丁酮∶甲酸∶水=8∶1∶1∶1預(yù)飽和15 min，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)清晰，365 nm熒光下檢視。相比對照品色譜，供試品顯相同的綠色或黃綠色熒光斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾斑點(diǎn)。見圖1。

圖1 淫羊藿薄層色譜圖（紫外365 nm）

2.1.2 鹽巴戟天[3-4]取本品細(xì)粉6g，置三角燒瓶中，加入乙醇50 ml，玻璃棒攪拌下溶解，超聲15 min，過濾，蒸干，殘?jiān)尤霟崴?0 ml，玻璃棒攪拌下溶解，二氯甲烷振搖提取2次，20 ml/次，合并二氯甲烷液，置蒸發(fā)皿中放置通風(fēng)櫥內(nèi)揮干，殘?jiān)? ml無水乙醇溶解，制成鹽巴戟天供試品溶液。取缺鹽巴戟天樣品6 g，同法制成鹽巴戟天陰性對照溶液。再取巴戟天對照藥材2.5 g，置圓底燒瓶中，加入乙醇25 ml，置回流裝置上加熱1 h，中速濾紙濾過，濾液置蒸發(fā)皿中蒸干，自“殘?jiān)尤霟崴?0 ml，玻璃棒攪拌下溶解”起制成巴戟天對照藥材溶液。按薄層層析法，點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，巴戟天對照藥材、鹽巴戟天供試品及鹽巴戟天陰性對照溶液分別為1、2、2 μl，以甲苯 : 乙酸乙酯：甲酸=8∶4∶0.1預(yù)飽和15 min，展開，取出，晾干，365 nm熒光下檢視。相比對照藥材色譜，供試品顯相同的藍(lán)色或藍(lán)白色熒光斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾熒光斑點(diǎn)，見圖2。

圖2 鹽巴戟天薄層色譜圖（紫外365 nm）

2.1.3 熟地黃[5-7]取本品細(xì)粉2 g，置三角燒瓶中，加入甲醇30 ml，置超聲儀上并設(shè)定溫度為45℃，超聲30 min，過濾，蒸干，殘?jiān)尤霟崴?0 ml，玻璃棒攪拌下溶解，水飽和正丁醇提取3次，30 ml/次，合并正丁醇液，以正丁醇飽和的水洗滌2次，60 ml/次，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml溶解，制成供試品溶液。再取缺熟地黃陰性樣品細(xì)粉2 g，自“置三角燒瓶中，加入甲醇50 ml，置超聲儀上并設(shè)定溫度為45℃，超聲30 min”起制成陰性對照溶液。另取熟地黃對照藥材2 g，自“置三角燒瓶中，加入甲醇30 ml，置超聲儀上并設(shè)定溫度為45℃，超聲30 min”起制成對照藥材溶液。按薄層層析法，點(diǎn)樣于同一硅膠GF254薄層板上，對照藥材、供試品及陰性對照溶液分別為10、3、3 μl，以石油醚（60～90℃） ∶乙酸乙酯=1∶1為展開劑，預(yù)飽和15 min，展開，取出，晾干，254 nm熒光下檢視。相比對照藥材色譜，供試品顯相同淺黑色或黑色熒光斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾熒光斑點(diǎn)，見圖3。

圖3 熟地黃薄層圖譜圖（紫外254 nm）

2.2 淫羊藿苷含量測定[8-12]

2.2.1 對照品溶液的制備 取淫羊藿苷0.0135 g，加甲醇定容至100 ml，超聲溶解，制成對照品溶液（0.135 mg/ml）。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品細(xì)粉約7.5 g，精密稱定，同“2.1.1 淫羊藿”供試品制備方法，制得“殘?jiān)庇脽o水乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，搖勻后用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取缺淫羊藿陰性樣品細(xì)粉約7.5 g，精密稱定，同“2.2.2”制成陰性對照溶液。

2.2.4 色譜條件[13]色譜柱：Rigol Compass C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相乙腈∶水=28∶72（v/v），柱溫30℃，檢測波長270 nm，流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量10 μl，淫羊藿苷峰理論板數(shù)≥3000。

2.2.5 方法學(xué)考察[14]系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取上述對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μl（平行2次），按“2.2.4”色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果顯示供試品與對照品色譜相應(yīng)的保留時(shí)間出現(xiàn)相應(yīng)的淫羊藿苷峰，而陰性對照在該處無該淫羊藿苷峰，分離度＞2.0，理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算≥3000。見圖4～6。

圖4 淫羊藿苷對照品

圖5 供試品

圖6 淫羊藿陰性對照

線性關(guān)系考察：分別取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成質(zhì)量濃度為0.025、0.050、0.100、0.200、0.300 mg/ml的對照品溶液。每個(gè)濃度組進(jìn)樣10 μl（每組進(jìn)樣兩次），按“2.2.4”色譜條件項(xiàng)測定，記錄淫羊藿苷峰面積。以淫羊藿苷濃度（mg/ml）為x坐標(biāo)軸、平均峰面積為y坐標(biāo)軸，計(jì)算得線性回歸方程及質(zhì)量濃度范圍分別為：y=13 524.5915x-22.6651（R2=0.9999），淫羊藿苷在0.025～0.300 mg/ml區(qū)間內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。見圖7。

圖7 淫羊藿苷線性關(guān)系考察擬合方程

精密度試驗(yàn)：取適量“2.2.1”項(xiàng)對照品溶液，按“2.2.4”項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣同一對照品溶液6次，每次進(jìn)樣量為10 μl，記錄各峰面積。結(jié)果RSD為1.27%，表明該色譜儀精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取“2.2.2”項(xiàng)同一供試品溶液適量（批號：20210812），室溫放置0、4、8、10、12 h后，按“2.2.4”項(xiàng)色譜條件，進(jìn)樣10 μl（平行2次）測定，記錄各淫羊藿苷峰面積，計(jì)算出RSD為1.63%（n=5），表明在室溫下12 h內(nèi)供試液的性質(zhì)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同批次樣品（批號：20210812）約7.5 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，進(jìn)樣量為10 μl，得淫羊藿苷的平均含量為0.14 mg/mg，計(jì)算出RSD為1.84%（n=6），表明本品含量測定方法重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)：取同批次（批號：20210812），已知淫羊藿苷含量6個(gè)樣品，每份約7.5 g，精密稱定，置100 ml錐形瓶中，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶，共6份，各精密量取0.5 ml，分別加入濃度為0.135 mg/ml的淫羊藿苷對照品試液1.1 ml，充分搖動(dòng)直到混合均一，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，再按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，進(jìn)樣量為10 μl，記錄峰面積，計(jì)算平均加樣回收率為103.51%，RSD為1.44%，結(jié)果顯示該方法具有良好的回收率。見表1。

表1 淫羊藿苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

樣品中淫羊藿苷含量測定：取連續(xù)3批次樣品約7.5 g，精密稱定，置100 ml錐形瓶中，分別按“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶，再按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，進(jìn)樣量為10 μl，平行2次進(jìn)樣。見表2。

表2 補(bǔ)腎生精片中淫羊藿苷的測定結(jié)果（n=2）

3 討論

本研究在原制劑注冊標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上增加了淫羊藿、鹽巴戟天、熟地黃三味藥材的薄層鑒別方法。經(jīng)過方法學(xué)考察，新增三味藥材薄層鑒別色譜特征斑點(diǎn)明顯，陰性對照無干擾，可納入該品種制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

在含量測定中采用了兩種方法制備本品供試品：方法一參考《中華人民共和國藥典》2020年版淫羊藿“含量測定”[15]下的供試品制備方法，結(jié)果檢測的雜質(zhì)成分多、淫羊藿苷色譜峰不明顯；方法二參考定性鑒別中“2.1.1淫羊藿”的供試品制備方法，結(jié)果顯示經(jīng)提純后的供試品雜質(zhì)成分少、淫羊藿苷色譜峰明顯。后經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，方法二的供試品制備方法重現(xiàn)性好、成分穩(wěn)定性好。如該制劑市場化，可以把本品所含淫羊藿苷的含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)申請藥品注冊批件。