高效液相色譜- 串聯質譜法測定動物源性食品中馬波沙星的殘留

陳 靈，欒慶祥，黃 鑫，金曉峰，趙 貴

（貴州省獸藥飼料檢測所，貴州貴陽 550003）

0 引言

馬波沙星（Marbofloxacin，MBF） 屬于氟喹諾酮類抗菌藥物，通過抑制細菌DNA 回旋酶活性，阻止其DNA 的合成復制，進而發揮抗菌作用，對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌和支原體表現出良好的抗菌效果[1-3]。馬波沙星給藥后吸收迅速完全，體內分布廣泛，生物利用度高，作用于體內多個組織[4-7]；常用于牛的呼吸道感染和急性乳房炎，豬的無乳綜合癥，以及犬貓的感染性疾病[8-13]。

目前，針對馬波沙星的檢測方法主要涉及酶聯免疫法[14-15]、膠體金免疫層析[16]、表面增強拉曼光譜（Surface Enhanced Raman Scattering，SERS）[17]、熒光探針法[18]、液相色譜法[19-21]、高效液相色譜- 串聯質譜法[22-23]。其中，液相色譜- 串聯質譜法具有靈敏度高、選擇性強等特點，對馬波沙星的殘留分析具有較大的優勢。在馬波沙星的已有檢測標準[24-25]中，也使用了液相色譜- 串聯質譜法，但方法的前處理過程較為繁瑣，各方法能檢測的樣品種類少，不能較好地滿足多種類樣品的快速準確檢測。鑒于馬波沙星常被應用于多種動物的疾病治療，在動物體內分布于多個靶組織中，需要一種能涵蓋多種動物組織的檢測方法。因此，建立了一種簡便快捷、高效靈敏且能滿足多種動物組織中馬波沙星檢測的HPLC-MS/MS 方法，為保證動物性食品的質量安全和馬波沙星的后續檢測標準研究提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

（1） 儀器。AB Sciex Triple 6500+三重四極桿液質聯用儀，上海SCIEX 分析儀器貿易有限公司產品；全自動智能氮吹儀、多樣品旋渦混合器，廣州得泰公司產品；ACQUITY HSS T3 型色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），美國沃特世公司產品；3K15 型高速冷凍離心機，德國Sigma 公司產品；KQ-500 DE產品數控超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司產品；0.22 μm wwPTFE 微孔濾膜，美國PALL 公司產品；Milli-Q Direct-Q10 產品超純水機，美國默克密理博公司產品。

（2） 試劑。乙腈（色譜級），美國默克公司提供；甲醇（質譜級），美國Fisher 公司提供；甲酸（質譜級），上海安譜實驗科技股份有限公司提供；乙酸（分析純），國藥集團化學試劑有限公司提供；正己烷（分析純），國藥集團化學試劑有限公司提供；試驗用超純水為Milli-Q Direct-Q10 超純水機制備。

馬波沙星-D8標準品（純度96%），加拿大Toronto Research Chemicals 公司提供；馬波沙星標準品（純度99.8%），中國獸醫藥品監察所提供。

試驗用的牛肉、牛肝、牛腎、牛脂肪、牛奶、豬肉、豬肝、豬腎、豬脂肪等9 種樣品，均購自當地市場。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

（1） 標準儲備液。準確稱取馬波沙星標準品10 mg，用乙腈溶解并稀釋至10 mL 容量瓶中，配制成質量濃度為1 mg/mL 的馬波沙星標準貯備液，0 ℃以下避光保存；準確稱取馬波沙星-D8標準品0.5 mg，用乙腈溶解并稀釋至10 mL 容量瓶中，得50 μg/mL 馬波沙星-D8標準貯備液，0 ℃以下避光保存。

（2） 標準中間液。準確量取馬波沙星標準儲備液0.1 mL，于100 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，配制成質量濃度為1 μg/mL 的馬波沙星標準中間液；準確量取馬波沙星-D8標準儲備液0.1 mL，于5 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，配制成質量濃度為1 μg/mL 的馬波沙星-D8標準中間液。

（3） 標準曲線工作溶液。準確量取馬波沙星中間液和馬波沙星-D8標準中間液適量，用0.1%甲酸水+甲醇（9+1） 配制成馬波沙星質量濃度為5，20，50，100，200，400 μg/L，馬波沙星-D8質量濃度均為10 μg/L 的馬波沙星系列標準工作溶液。

1.2.2 樣品的前處理

牛肉、牛肝、牛腎、牛脂肪、豬肉、豬肝、豬腎和豬脂肪均搗碎均質后使用，牛奶直接使用。

（1） 樣品提取。稱取試料2 g（準確至0.02 g），置于50 mL 離心管中，加入1 μg/mL 的馬波沙星-D8標準中間液20 μL，加入8 mL 的1%乙酸乙腈溶液，渦旋0.5 min，超聲振蕩10 min，于低溫5 ℃下以轉速10 000 r/min 離心5 min，取上清液轉入到另一10 mL 離心管中，于50 ℃下氮氣吹干，準確加入2 mL 的0.1%甲酸水+甲醇（9+1） 復溶，待凈化。

（2） 樣品凈化。于復溶液中加入正己烷4 mL，渦旋1 min，于低溫5 ℃下以轉速10 000 r/min 離心5 min，取下層溶液過0.2 μm 有機濾膜，供高效液相色譜- 串聯質譜儀測定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量1 μL，流動相A 為0.1 %甲酸水，B 為乙腈，梯度洗脫0～0.5 min，95%A；0.5～6.5 min，95%～80%A；6.5～7.0 min，80%～10%A；7.0～7.1 mim，10%～95%A；7.1～9.0 min，95%A。

1.2.4 質譜條件

電噴霧離子源（ESI）：正離子掃描；掃描方式為多反應監測（MRM），噴霧電壓5.5 kV，氣簾氣40 psi，噴霧氣45 psi，輔助氣40 psi，離子源溫度500 ℃。

馬波沙星和馬波沙星-D8的MRM參數見表1。

表1 馬波沙星和馬波沙星-D8 的MRM 參數

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優化

2.1.1 質譜條件的確定

馬波沙星屬于氟喹諾酮類藥物，分子結構含有多個N 原子而顯一定的弱堿性，因此選擇正離子模式電離。分別取質量濃度1 μg/mL 的馬波沙星和1 μg/mL 的馬波沙星-D8溶液進行全掃描，得到相應的準分子離子分，確定母離子。調整電離電壓和離子源溫度使母離子響應值最佳，最終確定電離電壓為5.5 kV，離子源溫度為500 ℃。對母離子進行子離子全掃描，確定定量離子對和定性離子對，并優化去簇電壓和碰撞能量，確定最佳參數。

2.1.2 色譜條件的確定

馬波沙星極性弱，具有良好的脂溶性，在反相C18色譜柱上具有良好的保留，選擇具有高分離能力、高耐壓性和pH 值適用范圍廣的Waters ACQUITY HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm） 色譜柱，試驗發現在該色譜柱條件下，目標化合物分離效果好、峰型尖銳對稱。試驗比較了水- 甲醇、水- 乙腈、0.1%甲酸水- 甲醇和0.1%甲酸水- 乙腈4 種流動相體系下的色譜峰形及響應值，發現用0.1%甲酸水- 乙腈作流動相時，目標化合物具有良好的響應，保留穩定、峰型好，柱壓也較低，因此確定0.1%甲酸水- 乙腈為流動相。在此條件下，馬波沙星MRM總離子流色譜圖。

馬波沙星的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 馬波沙星的總離子流色譜圖

2.2 提取溶劑的選擇

動物肌肉、內臟、脂肪和生鮮乳中含量較高的蛋白質和脂肪，對目標物的提取和后續的檢測有較大的干擾，提取溶劑應能最大限度地減少此類物質的提出。在常用的提取溶劑中，因馬波沙星在乙腈中具有良好的溶解性，且乙腈具有一定的蛋白沉淀作用，高速離心后可去除一定量的蛋白，同時乙腈能減少對脂肪的提取，因此選擇乙腈作為提取溶劑，能獲較好的回收率。由于馬波沙星的分子結構中含有多個N 原子，具有弱堿性，加入適量的乙酸使其離子化，增加極性，有利于提高馬波沙星在乙腈中的溶解度，試驗發現使用1%的乙酸乙腈提取時，在有效去除干擾雜質的同時能獲得良好的回收率。最終確定1%的乙酸乙腈作為提取溶劑。

2.3 凈化方式的選擇

試驗比較了3 種凈化方式：一是樣品經1%乙酸乙腈提取、氮氣吹干、0.1%甲酸水+甲醇（9+1） 復溶處理后，復溶液過0.22 μm 有機濾膜后直接上機測定；二是樣品經1%乙酸乙腈提取后，加入適量正己烷除脂，氮氣吹干，0.1%甲酸水+甲醇（9+1） 復溶后過0.22 μm 有機濾膜；三是樣品經1%乙酸乙腈提取、氮氣吹干、0.1%甲酸水+甲醇（9+1） 復溶后，復溶液經正己烷脫脂，取下層溶液過0.22 μm濾膜后上機測定。試驗發現，方法一未能有效地達到凈化的目的，得到的色譜圖雜峰較多、干擾大，較多的雜質還可能對儀器造成污染及損害；方法二和方法三得到的色譜圖基本一致，雜峰少、干擾小，但方法二需要消耗更多量的正己烷，綜合考慮凈化效果、經濟實用等因素，最終確定復溶后再脫脂的凈化方式。

2.4 復溶液的選擇

分別考查了乙腈：0.1%甲酸水（20∶80，V∶V）、乙腈：0.1%甲酸水（10∶90，V∶V）、甲醇：0.1%甲酸（20∶80，V∶V）、甲醇：0.1%甲酸水（10∶90，V∶V） 等4 種溶劑作為樣品氮氣吹干后的復溶液，對目標物的響應值和峰型的影響。試驗發現，當復溶液中有機相為乙腈時，雖然色譜峰峰型較好，但背景干擾比有機相為甲醇的復溶液時的背景干擾高；而當有機相為甲醇時，過高甲醇濃度會抑制目標物的響應。因此，最終確定樣品復溶液為甲醇：0.1%甲酸水（10∶90，V∶V）。

2.5 方法學的驗證

2.5.1 線性范圍和定量限、檢出限

取“1.3.1”制備的馬波沙星質量濃度為5，20，50，100，200，400 μg/L，馬波沙星-D8質量濃度均為10 g/L 的馬波沙星系列標準工作溶液，供液相色譜- 串聯質譜測定，以馬波沙星與馬波沙星-D8的峰面積比值為縱坐標（Y），馬波沙星的質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線。結果表明，在5.0～400.0 ng/mL 的濃度范圍內，馬波沙星呈現良好的線性關系，回歸方程為Y=0.235 67X-0.286 85，相關系數（R） 為0.999 6。在各基質中添加適量的標準溶液，以信噪比S/N＞3，確定檢出限（Limit of Detection，LOD） 為1.5 μg/kg；以信噪比S/N＞10，確定量限（Limit of quantitation，LOQ） 為5.0 μg/kg。

2.5.2 準確度和精密度

采用添加回收的方法考查該方法的準確度和精密度。根據相關標準對獸藥殘留檢測方法精密度和準確度的規定[26]，分別在豬肌肉、肝臟、腎臟和脂肪，以及牛肌肉、脂肪、肝臟、腎臟和牛奶的空白基質中添加適量馬波沙星標準溶液，每種空白基質添加4 個質量濃度水平，每個質量濃度進行3 批試驗，每批5 個平行樣品，按“1.3”的試驗方法進行前處理測定，分別計算每批單獨試驗的批內平均回收率、相對標準偏差（RSD） 和全部批次的批間平均回收率、相對標準偏差（RSD）。

馬波沙星的回收率和相對標準偏差見表2。

由表2 可知，肌肉、肝臟、腎臟添加質量濃度為5.0～300.0 μg/kg 時、脂肪添加質量濃度為5.0～100.0 μg/kg 時、牛奶添加質量濃度為5.0～150.0 μg/kg時，馬波沙星的平均回收率為82.6%～108.6%，相對標準偏差為0.45%～6.86%，該方法具有良好的準確度和精密度。

2.6 實際樣品測定

使用該方法對市場采購的牛肉、牛肝、牛腎、牛脂肪、牛奶、豬肉、豬肝、豬腎、豬脂肪等各10 批樣品進行檢測，均未檢出馬波沙星。

3 結論

建立了一種能同時滿足牛肉、牛肝、牛腎、牛脂肪、牛奶、豬肉、豬肝、豬腎和豬脂肪等9 種動物基質中馬波沙星殘留檢測的高效液相色譜- 串聯質譜法。該方法前處理簡單、靈敏度高、重現性好、涵蓋多種動物組織，適用于動物源性食品中馬波沙星殘留的快速檢測。