HLA-DRA蛋白在肝細胞癌中的表達及其臨床意義

陳琨 楊慧 劉子嘉 張曉林 徐卓一 劉柄 趙玉寶 丁璐 鄧陽

作者單位：250000 濟南 1.山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）公共衛生與健康管理學院；2.山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）臨床與基礎醫學院；271000 泰安 3.山東第一醫科大學第二附屬醫院感染性疾病科；250000 濟南 4.濟南市中心醫院公共衛生科

原發性肝癌居最常見惡性腫瘤的第六位和腫瘤死亡原因的第三位［1］。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原發性肝癌病例的80%以上，是其主要的組織學亞型［2］。大多數HCC 患者不具有特異性的臨床表現，且病情進展迅速，確診時往往已進展到中晚期，遠期預后差［3］。因此，探尋可用于HCC早期診療和預測預后的生物標志物極其重要。

人類白細胞抗原DRA（human leukocyte antigen-DRA，HLA-DRA）屬于HLA-Ⅱ類分子α鏈旁系同源基因，其編碼的α 鏈和HLA-DRB 編碼的β 鏈以非共價鍵結合組成異二聚體糖蛋白分子，即HLA-Ⅱ類分子［4-5］。HLA-Ⅱ類分子表達于抗原呈遞細胞表面，通過向T 細胞呈遞外源性抗原肽，在免疫應答和免疫調控中發揮關鍵作用［6］。在腫瘤中，HLA-DRA呈遞腫瘤相關抗原被CD4+T 細胞識別，產生細胞因子如白細胞介素和干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ），以抑制腫瘤生長［7］。前期研究發現HLA-DRA 蛋白表達于甲狀腺乳頭狀癌［8］、宮頸癌［9］、膀胱癌［10］、腎透明細胞癌［11］等腫瘤組織，并發揮免疫調控作用。然而，目前HLA-DRA 在HCC 中表達情況及臨床意義尚不清楚。因此，本研究通過免疫組織化學法檢測HCC 組織和對應癌旁組織中HLA-DRA 蛋白的表達情況，分析HLA-DRA 蛋白表達水平與患者臨床病理特征以及術后預后之間的關系，以期為HCC 患者提供新的早期診斷標志物。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2016 年7 月至2022 年3 月在山東第一醫科大學第二附屬醫院和濟南市中心醫院接受肝癌根治性切除術的HCC 患者作為研究對象。納入標準：⑴手術切除標本經病理組織活檢診斷為HCC；⑵術前未接受過手術治療、放化療、免疫治療等。排除標準：⑴同時患有嚴重影響生存的心臟、腎臟、肺部等疾病或其他類型的惡性腫瘤；⑵臨床資料和隨訪資料不完整。術中同時取得原發灶組織和癌旁組織，其中癌旁組織距離癌灶邊緣2 cm 以上并經病理學診斷證實為正常組織。本研究獲得山東第一醫科大學倫理委員會批準（審批號：倫審20231356號）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法檢測HLA-DRA 蛋白表達水平 將10%福爾馬林溶液固定的組織進行石蠟包埋，連續切片（切片厚度為4μm）。采用SP 法對切片進行染色，二甲苯脫蠟、乙醇梯度水化、3% H2O2溶液處理內源性過氧化物酶、熱修復抗原。加入1∶100 稀釋的HLA-DRA 一抗（AJ1362a，Abgent 公司），4 ℃孵育過夜。次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗。DAB溶液顯色，蘇木精復染，二甲苯洗片透明處理，中性樹脂封片，在顯微鏡下觀察切片。

1.2.2 結果判定及評分 隨機選擇5 個高倍鏡視野（×400）對每張切片中的陽性細胞進行計數。HLA-DRA蛋白主要表達于細胞膜和（或）細胞質，以細胞膜和（或）細胞質中出現棕褐色或棕黃色顆粒為陽性細胞。計算陽性細胞百分比，該百分比≤5%、6%～25%、26%～50%和＞50%分別計為0、1、2、3分。觀察細胞染色情況，根據染色強度計分，其中細胞無染色、淺黃色、棕黃色和棕褐色依次計為0、1、2、3 分。以陽性細胞百分比評分×細胞染色強度得分計為總評分［12］，總評分0 分判定為陰性（-），1～2 分為弱陽性（+），3～4 分為中度陽性（++），6～9分為強陽性（+++），將（-）或（+）判定為低表達，將（++）或（+++）判定為高表達。

1.3 資料收集與隨訪

通過查閱病歷資料，收集患者性別、年齡、HBV感染情況、BCLC 分期、肝硬化、Child-Pugh 分級、腫瘤大小、包膜完整性、微血管侵犯等資料。根據《原發性肝癌診療指南（2022 年版）》［13］建議的隨訪方案，在患者出院后采用門診復查的方式進行隨訪，兩年內每3 個月隨訪1次，隨后每6個月進行1次，隨訪截至2023年6月30日。總生存期（overall survival，OS）是指從患者進行手術的當天開始到因任何原因導致死亡的時間，無復發生存期（recurrence-free survival，RFS）是指從手術當天開始至腫瘤復發或隨訪截止日期或死亡日期（以先發生者為準）。

1.4 統計學方法

利用SPSS 25.0 和GraphPad Prism 8 軟件分析數據以及繪制統計圖。以例數（n）表示分類資料，兩組分類資料的比較采用χ2檢驗。利用Kaplan-Meier法描述HLA-DRA 表達水平與HCC 患者術后OS 和RFS 的關系，Log-rank 檢驗比較不同HLA-DRA 表達水平患者OS 和RFS 的差異。應用單因素和多因素Cox 比例風險回歸分析HCC 患者術后OS 和RFS 的影響因素。以雙側P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的臨床病理特征

本研究共納入273例HCC患者，其中男性235 例，女性38例；50歲及以下患者95例，50歲以上患者178例；HBsAg陽性者224例，陰性者49例；HBV DNA≤103IU/mL者144例，＞103IU/mL者129例；ALT≤40 U/L者104 例，＞40 U/L 者169 例；AST≤40 U/L 者96 例，＞40 U/L 者177 例；甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）≤400μg/L 者79 例，＞400μg/L 者194 例；腫瘤直徑≤5 cm 者168 例，＞5 cm 者105 例；161例患者伴有肝硬化，112例患者不伴有肝硬化；Child-Pugh 分級A 級248 例，B 級25 例；BCLC分期0/A期137例，B/C期136例；93例無包膜/包膜不完整，180 例包膜完整；96 例發生微血管侵犯，177例未發生微血管侵犯。

2.2 HLA-DRA 蛋白在HCC 組織和癌旁組織中的表達情況

HLA-DRA 蛋白在HCC 組織中的高表達率為39.19%（ 107/273），低于癌旁組織的72.89%（ 199/273），差異具有統計學意義（χ2=62.927，P＜0.001）。見圖1。

圖1 HLA-DRA蛋白在HCC組織和癌旁組織中的表達（SP，×400）Fig.1 Expression of HLA-DRA protein in HCC and paracancerous tissues (SP, ×400)

2.3 HLA-DRA 蛋白表達與HCC 患者臨床病理特征的關系

HCC組織中HLA-DRA蛋白高表達與AFP＞400μg/L（χ2=8.984，P=0.003）、伴有肝硬化（χ2=6.223，P=0.013）、BCLC B/C 分期（χ2=9.910，P=0.002）、無包膜/包膜不完整（χ2=7.616，P=0.006）以及微血管侵犯（χ2=4.727，P=0.030）有關，但未發現與患者性別、年齡、HBsAg、HBV DNA、ALT、AST、腫瘤大小以及Child-Pugh分級有關（均P＞0.05）。見表1。

表1 HLA-DRA蛋白表達與HCC患者臨床病理特征的關系Tab.1 Association between HLA-DRA protein expression and clinicopathological characteristics of patients with HCC

2.4 HLA-DRA蛋白表達與HCC患者預后的關系

截至2023 年6 月30 日，273 例HCC患者的中位OS 為45.07（95%CI：34.01～56.13）個月，1、3 和5年OS率分別為77.4%、55.3%和37.9%。107例HLA-DRA蛋白高表達者中位OS為55.35（95%CI：48.83～61.87）個月，1、3和5年OS率分別為86.6%、65.4%和40.1%，而166例低表達者中位OS為30.58（95%CI：15.45～45.71）個月，1、3 和5 年OS 率分別為70.8%、47.5%和38.6%。Logrank 檢驗顯示，HLA-DRA 高表達者OS 率高于低表達者（χ2=4.336，P=0.037），見圖2A。

圖2 HLA-DRA蛋白表達與HCC患者預后的關系Fig.2 Association between HLA-DRA protein expression and prognosis of patients with HCC

HCC 患者的中位RFS 為15.60（95%CI：11.27～19.94）個月，1、3和5年RFS率分別為56.4%、31.3%和18.7%。107 例HLA-DRA 蛋白高表達者中位RFS 為33.05（95%CI：24.03～42.07）個月，1、3 和5 年RFS 率分別為70.2%、41.6%和22.0%，而166 例低表達者中位RFS為11.40（95%CI：9.41～13.39）個月，1、3和5年RFS率分別為46.1%、22.9%和17.5%。Log-rank檢驗顯示，HLA-DRA 高表達者RFS率高于低表達者（χ2=13.396，P＜0.001），見圖2B。

2.5 影響HCC 患者預后的單因素和多因素Cox 比例風險回歸分析

單因素分析發現AFP、伴有肝硬化、BCLC 分期、無包膜/包膜不完整、微血管侵犯、HLA-DRA 表達水平與HCC患者OS相關（均P＜0.05）。多因素分析結果顯示，AFP＞400μg/L、伴有肝硬化、BCLC B/C 分期、無包膜/包膜不完整、微血管侵犯是HCC 患者術后OS 的獨立危險因素（均P＜0.05），而HLA-DRA 蛋白高表達是HCC 患者術后OS 的獨立保護因素（HR=0.657，95%CI：0.492～0.898，P=0.021）。見表2。

表2 Cox比例風險回歸分析影響HCC患者OS的因素Tab.2 Cox proportional hazards regression analysis of factors affecting OS in patients with HCC

單因素分析顯示，AFP、伴有肝硬化、BCLC 分期、無包膜/包膜不完整、微血管侵犯、HLA-DRA表達水平與HCC 患者RFS 相關（均P＜0.05）。多因素分析結果顯示，AFP＞400 μg/L、BCLC B/C 分期、無包膜/包膜不完整、微血管侵犯是HCC 患者術后RFS 的獨立危險因素（均P＜0.05），HLA-DRA 蛋白高表達是HCC 患者術后RFS 的獨立保護因素（HR=0.668，95%CI：0.549～0.857，P=0.008）。見表3。

表3 Cox比例風險回歸分析影響HCC患者RFS的因素Tab.3 Cox proportional hazards regression analysis of factors affecting RFS in patients with HCC

3 討論

正常情況下HLA-DRA 僅表達于幾種免疫活性細胞中，但是在病理狀態下如病毒感染、自身免疫性疾病和腫瘤發生時，HLA-DRA 蛋白表達增加，主要發揮抗原呈遞和T 細胞激活調控，將腫瘤抗原性多肽呈遞給CD4+T 細胞，使腫瘤細胞被免疫細胞識別并殺傷，抑制腫瘤發生發展［14-15］。然而，腫瘤組織中HLA-DRA 蛋白表達水平下降，誘導HLA-DRA基因啟動子區和/或Ⅱ類反式激活因子的高甲基化或低乙?；筎h1 細胞因子如IFN-γ 和TNF-α 分泌減少，進而抑制CD8+T 細胞的激活，最終導致腫瘤免疫監視缺失［7，16］。

由IFN-γ 誘導的HLA-DRA 是CD4+T 細胞識別腫瘤相關抗原所必需的。有研究報道，在癌旁的正常結直腸上皮中HLA-DRA 呈高表達，而結直腸癌組織中HLA-DRA 表達水平較低，且HLA-DRA mRNA 表達與組織中的IFN-γ mRNA 水平相關，IFN-γ 則通過stat1依賴性機制抑制體內c-myc 的表達，這種非免疫機制使患者預后更好［17］。YAN 等［18］對宮頸鱗狀細胞癌中的HLA-DRA基因進行GSEA 富集分析，發現其主要富集于免疫或腫瘤相關信號通路，包括PD-1 檢查點通路、PD-L1表達、腫瘤T 細胞受體信號通路、Th1/Th2細胞分化途徑、NF-κB 信號傳導、抗原處理呈遞、B 細胞受體信號通路、趨化因子信號通路和Th17 細胞分化等。本研究發現在HCC 組織中HLA-DRA 蛋白高表達率低于癌旁組織，且與多個因素相關，包括AFP＞400μg/L、伴有肝硬化、BCLC B/C 分期、無包膜/包膜不完整以及微血管侵犯等。

HLA-DRA 與多種免疫細胞如巨噬細胞、樹突狀細胞、CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、中性粒細胞和B 細胞的浸潤豐度呈正相關，因此檢測HLA-DRA 表達的動態變化有助于反映患者的免疫狀態，且HLA-DRA 表達降低是T 細胞分化異常的重要原因之一［18］。在腫瘤中，HLA-DRA 高表達常與腫瘤浸潤淋巴細胞、瘤周淋巴細胞相關，也與多種腫瘤患者預后良好相關［19］。例如，在結直腸癌組織中HLA-DRA 高表達與患者預后良好相關［17］。安雯等［20］對105 例胃癌組織標本進行免疫組織化學檢測發現HLA-DRA 高表達患者相比低表達患者的生存優勢更加明顯，HLA-DRA 高表達是患者預后的獨立保護因素。MATOBA 等［21］發現HCC 組織中HLA-DRA 蛋白低表達與早期肝內復發顯著相關，是HCC 早期肝內復發的獨立危險因素。還有研究報道，HLA-DRA 在基因和蛋白質水平上的低表達與兒童腎上腺皮質瘤患者OS 降低相關［19］。HLA-DRA 蛋白低表達也可預測骨肉瘤的不良OS 和RFS［22］。HLA-DRA 蛋白高表達的腎透明細胞癌患者OS 較好，且是患者預后的獨立保護因素［11］。本研究也發現HLA-DRA 蛋白高表達者1、3 和5 年OS 率和RFS 率均高于低表達者，且HLA-DRA 高表達是患者術后OS 和RFS 的獨立保護因素。然而，HLA-DRA 蛋白低表達的非肌肉浸潤性膀胱癌患者無進展生存率高于高表達者（P=0.004）［10］。可見，HLA-DRA 表達水平與不同類型的腫瘤患者術后預后的關系存在一定的差異，這可能與HLA-DRA 等免疫相關分子在不同類型腫瘤的免疫應答和進展中發揮促癌或抑癌作用的差異性有關。

本研究也存在以下局限性：⑴未開展功能實驗探索HLA-DRA 蛋白在HCC 發生發展中的具體作用機制；⑵本研究屬于單中心研究，需要多中心大樣本臨床研究進行驗證。

綜上所述，HCC 組織中HLA-DRA 蛋白的高表達率低于癌旁組織，其表達水平與AFP、肝硬化、BCLC分期、無包膜/包膜不完整以及微血管侵犯相關。HLA-DRA 蛋白高表達是HCC 患者預后的獨立保護因素。因此，識別HLA-DRA 蛋白的高表達水平可能有助于早期發現HCC病變，從而提供更有效的治療方案和改善患者預后機會。