糖酵解在非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥中的作用研究

李楠 路晨陽 祝阿妮 楊棟才 馬倩 嚴(yán)奉奇 賈衛(wèi)紅

作者單位：710083 西安 1.西北大學(xué)附屬醫(yī)院西安市第三醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科；710038 西安 2.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院泌尿外科

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是其主要的病理類型，約占所有肺癌的80%～85%，且大部分的NSCLC患者初診時即為晚期［1］。吉非替尼（Gefitinib）是第一代廣泛用于晚期NSCLC 患者一線治療的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI），可通過阻斷表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）磷酸化抑制腫瘤進(jìn)展［2］。吉非替尼對大部分具有EGFR激活突變的NSCLC患者最初都有效，但幾乎所有患者在治療后都會出現(xiàn)吉非替尼耐藥［3］。自2005 年首次發(fā)現(xiàn)T790M耐藥突變以來，越來越多的吉非替尼耐藥機(jī)制被發(fā)現(xiàn)［4-5］。盡管吉非替尼耐藥機(jī)制的研究已取得了巨大的進(jìn)展，但是不同機(jī)制間可以相互影響，且仍有部分耐藥機(jī)制尚不清楚［6］，包括吉非替尼耐藥在物質(zhì)代謝方面的研究尚不清楚。本研究通過構(gòu)建NSCLC吉非替尼耐藥細(xì)胞，探討吉非替尼耐藥與糖酵解的關(guān)系，以期為進(jìn)一步闡明NSCLC的吉非替尼耐藥機(jī)制，逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人NSCLC細(xì)胞PC-9和A549由空軍軍醫(yī)大學(xué)張艱教授惠贈；吉非替尼（ZD1839）購自Selleck Chemicals公司；2-脫氧-D-葡萄糖［（2-deoxy-D-glucose，2-DG），（154-17-6）］購自MedChemExpress公司；CCK-8檢測試劑盒（CK04）購自Dojindo Laboratories公司；乳酸測試盒（A019-2-1）購自南京建成生物工程研究所有限公司；葡萄糖攝取檢測試劑盒（S0201M）、Trizol（R0011）和RIPA裂解液（P0013C）均購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR037A）、SYBR Green PCR Master Mix（RR820A）購自Takara Bio 公司；qRT-PCR引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成；HK1（2024T）、HK2（2106S）、PKM2（4053T）、LDHA（43723SF）、PFKP（12746S）和β-Actin（4970S）抗體及HRP-IgG（7074）二抗購自Cell Signaling Technology 公司；RPMI 1640 培養(yǎng)液（11875176）、胎牛血清（A5209401）購自HyClone公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及耐藥細(xì)胞株構(gòu)建

人NSCLC 親本細(xì)胞PC-9 和A549 均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，條件為37 ℃、5% CO2。采用濃度遞增法構(gòu)建NSCLC 吉非替尼耐藥細(xì)胞PC-9-GR、A549-GR，具體如下：親本細(xì)胞PC-9 和A549 貼壁生長24 h 進(jìn)入對數(shù)生長期后，分別以含0.20μmol/L、0.50μmol/L、1.00μmol/L、1.50μmol/L 和2.00μmol/L 吉非替尼的培養(yǎng)基依次遞增持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，各濃度吉非替尼誘導(dǎo)2～3 周，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定3 d后調(diào)整為更高濃度繼續(xù)誘導(dǎo)，最終能在含2.00μmol/L吉非替尼的培養(yǎng)基中穩(wěn)定存活的細(xì)胞即為耐藥細(xì)胞PC-9-GR和A549-GR。

1.3 CCK-8實(shí)驗檢測細(xì)胞活力

親本和耐藥細(xì)胞（PC-9、PC-9-GR、A549、A549-GR）分別接種至96 孔板（5×103個/孔），待細(xì)胞貼壁，吸棄上清液，按0.00 μmol/L、0.02 μmol/L、0.20 μmol/L、2.00 μmol/L、20.00 μmol/L 分組并分別加入200 μL 含相應(yīng)濃度吉非替尼的培養(yǎng)基，檢測不同濃度的吉非替尼對細(xì)胞活力的影響；按0.00 mmol/L、0.10 mmol/L、0.50 mmol/L、1.00 mmol/L、5.00 mmol/L 分組并分別加入200 μL含有相應(yīng)濃度2-DG的培養(yǎng)基，檢測不同濃度的2-DG 對細(xì)胞活力的影響。將耐藥細(xì)胞按吉非替尼（0.00 μmol/L、0.02 μmol/L、0.20 μmol/L、2.00 μmol/L、20.00 μmol/L）單藥或聯(lián)合2-DG（0.50 mmol/L）分組，分別加入200 μL含相應(yīng)濃度吉非替尼或吉非替尼+2-DG的培養(yǎng)基，檢測吉非替尼聯(lián)合2-DG 對耐藥細(xì)胞活力的影響。以上實(shí)驗各組均設(shè)5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；吸棄上清液，加入100 μL 預(yù)先在避光條件下以1∶10比例配置含CCK-8 試劑的培養(yǎng)基，3 h 后用酶標(biāo)儀讀取各孔在450 nm 波長處的光密度（OD）值，并計算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=［（OD待測組-OD空白組）/（OD0.00μmol/L組-OD空白組）］×100%。

1.4 平板克隆形成實(shí)驗檢測細(xì)胞克隆形成情況

親本和耐藥細(xì)胞分別取1×103個細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿內(nèi)并搖勻，細(xì)胞貼壁后更換為含2.00μmol/L吉非替尼的培養(yǎng)基（10 mL）繼續(xù)培養(yǎng)，待肉眼可見細(xì)胞克隆形成后，取出培養(yǎng)皿，吸棄上清液，經(jīng)PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色后，拍照，用Image J軟件計數(shù)并制圖。

1.5 葡萄糖攝取檢測試劑盒檢測細(xì)胞葡萄糖代謝情況

親本和耐藥細(xì)胞分別接種至6孔板（1×106個/孔），同時設(shè)置空白組，每組各設(shè)3 個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基（3 mL），繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集上清液（即樣本液）。根據(jù)葡萄糖攝取檢測試劑盒說明書操作方法，配置標(biāo)準(zhǔn)濃度葡萄糖溶液（即標(biāo)準(zhǔn)液）后，分別測定標(biāo)準(zhǔn)液與樣本液于505 nm 波長處的OD 值并計算各孔上清液中的葡萄糖含量。各組細(xì)胞葡萄糖消耗量即空白組與實(shí)驗組葡萄糖含量之差。

1.6 乳酸測試盒檢測細(xì)胞乳酸產(chǎn)出水平

親本和耐藥細(xì)胞分別接種至6孔板（1×106個/孔），同時設(shè)置空白組，每組各設(shè)3 個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基（3 mL），繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集上清液（即樣本液）。根據(jù)乳酸測試盒說明書的操作方法，配置標(biāo)準(zhǔn)濃度乳酸溶液（即標(biāo)準(zhǔn)液）后，分別測定標(biāo)準(zhǔn)液與樣本液于530 nm 波長處的OD 值并計算各孔上清液中的乳酸含量。各組細(xì)胞乳酸產(chǎn)出水平即實(shí)驗組與空白組乳酸含量之差。

1.7 qRT-PCR 實(shí)驗檢測細(xì)胞內(nèi)糖酵解關(guān)鍵酶的mRNA水平

收集各組細(xì)胞，4 ℃條件下用Trizol提取各組細(xì)胞中的總RNA 并測定濃度后，取500 ng RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的方法反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄程序：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃保存。將所得cDNA稀釋5倍后，取cDNA 2μL、SYBR Green PCR Master Mix 5μL、上下游引物各1μL、ddH2O 1μL，混合，各樣本均設(shè)置5 個復(fù)孔，按PCR 擴(kuò)增程序（95 ℃變性30 s、65 ℃退火5 s、72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)），測得各樣本CT值。以β-Actin 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各樣本中目的mRNA的相對表達(dá)量。PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR

1.8 Western blot 實(shí)驗檢測細(xì)胞內(nèi)糖酵解關(guān)鍵酶的蛋白水平

收集各組細(xì)胞，用RIPA 裂解液裂解，提取細(xì)胞中的總蛋白并測定濃度。取20 μg蛋白樣品上樣至SDSPAGE凝膠孔內(nèi)，分別按濃縮膠80 V、分離膠120 V電壓電泳100 min，100 V 恒壓轉(zhuǎn)膜120 min，取出硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜并封閉洗滌，分別加入HK1（1∶1 000）、HK2（1∶1 000）、PKM2（1∶1 000）、LDHA（1∶1 000）、PFKP（1∶1 000）、β-Actin（1∶1 000）抗體孵育過夜，洗滌NC 膜，加入相應(yīng)二抗，繼續(xù)孵育1 h，洗滌后用ECL 處理并發(fā)光顯像，得到目的蛋白條帶。以β-Actin為內(nèi)參，利用Image J 軟件分析條帶的灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 15.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間采用兩獨(dú)立樣本t檢驗對比分析；同一樣本組內(nèi)不同濃度間，以0.00μmol/L 為參照，采用Dunnett-t 檢驗對比分析；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞吉非替尼耐藥性

CCK-8 實(shí)驗結(jié)果（圖1A）顯示，與0.00 μmol/L 組相比，不同濃度（0.02、0.20、2.00、20.00 μmol/L）吉非替尼處理PC-9、PC-9-GR、A549和A549-GR細(xì)胞后，親本與耐藥細(xì)胞的活力均下降，但相較于各自親本細(xì)胞，PC-9-GR 與A549-GR 細(xì)胞均顯示出更強(qiáng)的吉非替尼抵抗效應(yīng)（均P＜0.01）。其中，高濃度（20.00μmol/L）吉非替尼作用時，PC-9細(xì)胞與PC-9-GR細(xì)胞相對活力分別為（23.26±4.98）%和（40.72±5.32）%，A549 細(xì)胞與A549-GR 細(xì)胞相對活力分別為（17.62±6.41）%和（35.62±5.20）%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。平板克隆形成實(shí)驗結(jié)果（圖1B）顯示，2.00μmol/L吉非替尼處理PC-9、PC-9-GR、A549 和A549-GR 細(xì)胞后，與各自親本細(xì)胞相比，PC-9-GR 與A549-GR 細(xì)胞的克隆形成個數(shù)均顯著增加［細(xì)胞：（PC-9/PC-9-GR99.80±12.46）個vs（493.80±22.58）個，P＜0.001;A549/A549-GR細(xì)胞：（106.80±16.33）個vs（416.00±32.52）個，P＜0.001］。以上實(shí)驗結(jié)果表明，吉非替尼耐藥細(xì)胞株構(gòu)建成功。

圖1 親本和耐藥細(xì)胞的吉非替尼耐藥性情況Fig.1 Resistance of parents and drug-resistant cells to Gefitinib

2.2 細(xì)胞葡萄糖代謝和乳酸產(chǎn)出水平

細(xì)胞葡萄糖代謝水平檢測結(jié)果（圖2A）顯示，相較于各自親本細(xì)胞，PC-9-GR 與A549-GR 細(xì)胞均具有更高的葡萄糖代謝速率（PC-9/PC-9-GR 細(xì)胞：1.00±0.10vs1.37±0.10，P=0.002；A549/A549-GR 細(xì)胞：1.00±0.09vs1.46±0.14，P=0.009），提示PC-9 和A549細(xì)胞的吉非替尼耐藥產(chǎn)生伴隨著葡萄糖代謝的增強(qiáng)。

圖2 親本和耐藥細(xì)胞的葡萄糖代謝和乳酸產(chǎn)出水平Fig.2 Glucose metabolism and lactate production levels in parents and drug-resistant cells

鑒于糖酵解在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用及乳酸是葡萄糖代謝中糖酵解途徑的重要代謝產(chǎn)物［7］，為進(jìn)一步明確PC-9-GR 和A549-GR 細(xì)胞葡萄糖代謝變化的具體方式，通過乳酸測試盒檢測兩種細(xì)胞與各自親本細(xì)胞的乳酸產(chǎn)出水平，結(jié)果（圖2B）顯示，相較于各自親本細(xì)胞，PC-9-GR 與A549-GR 細(xì)胞都具有更高的乳酸產(chǎn)出水平（PC-9/PC-9-GR 細(xì)胞：1.00±0.08vs1.85±0.16 ，P=0.001； A549/A549-GR細(xì)胞：1.00±0.10vs1.64±0.17，P=0.005），提示PC-9 和A549 細(xì)胞的吉非替尼耐藥產(chǎn)生伴隨的葡萄糖代謝變化可能與糖酵解增強(qiáng)相關(guān)。

2.3 細(xì)胞內(nèi)糖酵解關(guān)鍵酶的表達(dá)水平

通過qRT-PCR 實(shí)驗分別檢測PC-9、PC-9-GR、A549 和A549-GR 細(xì)胞內(nèi)糖酵解關(guān)鍵酶HK（HK1、HK2）、LDH（LDHA、LDHB）、PKM（PKM1、PKM2）和PFK 的mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果（圖3A）顯示，相較于各自親本細(xì)胞，PC-9-GR 與A549-GR 細(xì)胞中HK2、LDHA和PFK 的mRNA 表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001），提示糖酵解關(guān)鍵酶的過表達(dá)可能參與了NSCLC 細(xì)胞的吉非替尼耐藥。為進(jìn)一步驗證qRTPCR 實(shí)驗結(jié)果，通過Western blot 實(shí)驗檢測糖酵解關(guān)鍵酶的蛋白水平，結(jié)果（圖3B）顯示，相較于各自親本細(xì)胞，PC-9-GR和A549-GR 細(xì)胞中糖酵解關(guān)鍵酶HK2、LDHA、PKM2和PFKP的蛋白表達(dá)水平增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001），進(jìn)一步證實(shí)糖酵解關(guān)鍵酶的過表達(dá)可能參與了NSCLC細(xì)胞的吉非替尼耐藥。

圖3 親本和耐藥細(xì)胞內(nèi)糖酵解關(guān)鍵酶的mRNA和蛋白表達(dá)水平Fig.3 The mRNA and protein expression levels of key enzymes of glycolysis in parents and drug-resistant cells

2.4 抑制糖酵解對細(xì)胞活力和吉非替尼耐藥性的影響

為進(jìn)一步驗證糖酵解變化對吉非替尼耐藥的影響，采用梯度濃度的糖酵解抑制劑2-DG分別處理PC-9、PC-9-GR、A549 和A549-GR 細(xì)胞，CCK-8 實(shí)驗檢測結(jié)果（圖4A）顯示，與0.00 mmol/L組相比，0.10 mmol/L和0.50 mmol/L 的2-DG 對PC-9、PC-9-GR、A549 和A549-GR 細(xì)胞的活力均無明顯影響（均P＞0.05），但2-DG 濃度增至1.00 mmol/L和5.00 mmol/L時，其對親本和耐藥細(xì)胞的活力有抑制作用，且對耐藥PC-9-GR細(xì)胞［（94.62±4.74）%vs（90.38±5.93）%，P=0.246；（83.84±6.94）%vs（69.66±9.50）%，P=0.027］和A549-GR 細(xì)胞［（93.84±5.13）%vs（83.96±7.83）%，P=0.028；（78.11±3.77）%vs（58.13±4.60）%，P＜0.001］的抑制作用更明顯，提示吉非替尼耐藥細(xì)胞對糖酵解依賴性更強(qiáng)，糖酵解可能參與了吉非替尼的耐藥形成。

圖4 抑制糖酵解對細(xì)胞活力和吉非替尼耐藥性的影響Fig.4 Effects of inhibiting glycolysis on cell viability and Gefitinib resistance

為消除2-DG 自身對細(xì)胞活力的影響，進(jìn)一步利用0.50 mmol/L 2-DG抑制糖酵解后檢測不同濃度的吉非替尼對PC-9-GR 和A549-GR 細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，結(jié)果（圖4B）顯示，與相應(yīng)濃度的吉非替尼單藥組相比，0.02 μmol/L、0.20 μmol/L 和2.00 μmol/L 吉非替尼聯(lián)合2-DG 組耐藥細(xì)胞的相對活力均降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），而0.00μmol/L和20.00μmol/L吉非替尼聯(lián)合2-DG 組耐藥細(xì)胞的相對活力則無明顯變化（均P＞0.05），提示抑制糖酵解可部分逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞對吉非替尼的耐藥性，糖酵解的激活參與了吉非替尼的耐藥形成。

3 討論

代謝重編程是腫瘤為滿足能量、物質(zhì)等方面的需求而對物質(zhì)代謝方式作出的改變，可改變細(xì)胞狀態(tài)、基因表達(dá)甚至微環(huán)境并影響腫瘤進(jìn)展和耐藥等［8-9］。代謝重編程主要包括葡萄糖、脂質(zhì)和谷氨酰胺等物質(zhì)的代謝改變，其中葡萄糖代謝變化是代謝重編程的主要體現(xiàn)方式。腫瘤的葡萄糖代謝重編程主要表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞傾向于通過有氧糖酵解而不是線粒體氧化磷酸化途徑滿足其能量需求，也被稱為Warburg 效應(yīng)［8］。Warburg 效應(yīng)在腫瘤中普遍存在，已被認(rèn)定為腫瘤的十大特征之一［10］。隨著對Warburg 效應(yīng)研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)提示其可能影響抗腫瘤藥物的療效［9，11］。HK、PFK、PK和LDH 是糖酵解關(guān)鍵酶，研究證實(shí)在多種耐藥腫瘤細(xì)胞中糖酵解關(guān)鍵酶和其代謝產(chǎn)物乳酸水平升高，提示糖酵解可能參與腫瘤耐藥過程［11-13］。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌、乳腺癌、食管癌等多種耐藥腫瘤組織中HK2、PFK、PKM2 和LDH等過表達(dá)，且與多種腫瘤化療和靶向治療的耐藥密切相關(guān)［14-15］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)在NSCLC 吉非替尼耐藥細(xì)胞中葡萄糖代謝速率升高，乳酸產(chǎn)出水平增加，且HK2、LDHA、PFKP 和PKM2 表達(dá)明顯升高，說明在吉非替尼耐藥細(xì)胞中糖酵解活性增強(qiáng)，提示糖酵解的激活可能參與了NSCLC 的吉非替尼耐藥，且該過程可能與糖酵解酶的表達(dá)升高有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)PKM2 僅僅體現(xiàn)蛋白水平升高，但mRNA 水平變化不大，提示PKM2 可能是通過轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)PKM2的表達(dá)升高。

隨著對糖酵解在腫瘤耐藥中作用的不斷認(rèn)識，研究者開始探索靶向腫瘤糖代謝重編程以降低腫瘤耐藥性，并開發(fā)了一系列針對糖酵解關(guān)鍵酶的抑制劑［16］。例如，有研究報道己糖激酶抑制劑2-DG 可以有效逆轉(zhuǎn)乳腺癌對曲妥珠單抗的耐藥性［17］；PKM2 抑制劑紫草素、二甲雙胍和維生素K 等可以改善結(jié)腸癌、膀胱癌和宮頸癌等對鉑類藥物的耐藥性［18］。PFK和LDH 抑制劑也正在開發(fā)中［19］，結(jié)果值得期待。雖然當(dāng)前開發(fā)的糖代謝通路關(guān)鍵酶抑制劑還處在初步階段，但現(xiàn)有的研究結(jié)果提示其在逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性方面具有廣闊的前景［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于各自親本細(xì)胞，2-DG 對耐藥細(xì)胞活力的抑制作用更強(qiáng)，說明吉非替尼耐藥細(xì)胞更依賴糖酵解；同時吉非替尼聯(lián)合2-DG 可增強(qiáng)吉非替尼對耐藥細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，提示抑制糖酵解可能逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥，這進(jìn)一步證實(shí)了糖酵解的激活可能參與了吉非替尼的耐藥過程。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC 吉非替尼耐藥伴隨糖酵解的激活和糖酵解關(guān)鍵酶表達(dá)升高，抑制糖酵解可部分逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥，且該過程可能通過提高糖酵解關(guān)鍵酶表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)，因此抑制其水平或活性可能是治療吉非替尼耐藥性NSCLC 的有效策略。本研究證實(shí)了糖酵解的激活與NSCLC 的吉非替尼耐藥有關(guān)，進(jìn)一步揭開了吉非替尼耐藥機(jī)制。但該結(jié)論僅進(jìn)行了體外實(shí)驗論證，缺乏相關(guān)動物學(xué)研究的進(jìn)一步論證，且其具體調(diào)控機(jī)制亦有待進(jìn)一步研究。