生物體中氨基酸單體碳穩定同位素測試方法研究

梁建鑫，尹希杰，2*，蘇 靜，林錫煌，李玉紅

（1.自然資源部第三海洋研究所 分析測試中心，福建 廈門 361005；2.中國地質調查局舟山海洋地質災害野外科學觀測研究站，山東 青島 266237）

生物代謝過程中的同位素分餾效應會導致代謝產物的各元素同位素（2H、18O、13C 和15N）組成存在顯著差異，使得肌肉等組織的整體同位素組成不能針對性地反映某類化合物在生物體內的生理特性、合成機制和代謝過程等［1］。蛋白質是生物體最重要的生命物質，氨基酸單體是組成蛋白質的基本單元，參與機體代謝和其他生理功能。在過去的幾十年里，氨基酸單體穩定同位素分析測試及研究（AACSIA）一直是相關領域的研究熱點，通過使用有機化學等方法提取并純化氨基酸，衍生化后經過色譜分離，再經過氧化和還原使這些氨基酸單體轉化為CO2和N2，通過同位素比值質譜（IRMS）進行分析測試，可獲得整體穩定同位素難以提供的更為詳細、獨特的信息，在生物代謝［2］、考古學［3］、醫學［4］、生態學［5］等領域具有重要的應用價值和前景［6］。

目前用于測試氨基酸濃度的技術方法比較成熟，如柱后衍生反相高效液相色譜法（PC-HPLC）、柱前衍生反相高效液相色譜法（RP-HPLC）、氣相色譜法（GC）等。氨基酸單體碳同位素過去一般采用離線方法檢測：經過一系列繁瑣的步驟分離并純化氨基酸單體后定量，再離線轉化為CO2氣體或者將純化的氨基酸單體直接通過元素分析儀-同位素比值質譜聯用技術測試其碳同位素組成。離線方法前處理流程復雜、過程繁瑣、人為操作誤差較大，且樣品需求量多，極大地限制了氨基酸單體碳同位素技術在相關科研領域的應用。上世紀90年代開發的氨基酸衍生化方法為氨基酸單體的氣相色譜-燃燒-同位素比值質譜（GC-C-IRMS）在線分析測試技術帶來了重大突破。此方法摒棄了傳統氨基酸單體碳穩定同位素分析方法的繁瑣前處理流程，極大地提高了檢出限和檢測效率，能對環境中各類樣品的微量氨基酸單體碳同位素進行高精度、高靈敏度和高準確性的分析測試，目前已經成為氨基酸單體同位素分析測試的主流方法。

由于氨基酸單體的官能團均為極性和非揮發性，在利用GC 檢測前須進行衍生化反應，通過酯化、酰化和硅烷化［7］等轉化成極性弱、熱穩定性好且易揮發的離子化合物，再通過氣相色譜分離和檢測。目前氨基酸的衍生化方法很多［7-8］，然而這些方法各有優缺點：例如硅烷化［9-10］的優勢是反應速度快，只需一步反應即可完成衍生化，隨后即可直接進行測定；但其產物不穩定，會形成多個副產物，且基團中的硅可能在GC-C-IRMS的氧化管中形成碳化硅（SiCx），導致目標化合物不完全轉化為CO2，從而產生同位素分餾，且SiCx等會在高溫下升華，可能進入質譜儀并污染離子源；含氟基團［11］的衍生化方法反應速度快，產物的色譜分離效果好，但在氧化管中會產生CuF2和NiF2，降低燃燒效率；其他一些乙酰化［1］等方法也存在產物色譜分離效果較差，需要添加的輔助試劑過多等情況。綜合考慮各種衍生化方法的效果［12］，并比較其優缺點（見表1），本研究選擇使用N-新戊酰基-O-異丙酯（NPP）法進行衍生化，并以海參、海藻為生物樣品進行氨基酸單體碳同位素檢測。

表1 氨基酸各衍生化方法的優缺點對比Table.1 Comparison of advantages and disadvantages of amino acids derivatization methods

本文優化了海參和海藻樣品氨基酸單體的提取、純化和衍生化等前處理流程，通過NPP 方法衍生化后（見圖1），分別利用GC-MS和GC-C-IRMS測試其氨基酸單體含量及碳同位素組成，并對該流程和方法測試結果的平行性、精密度、準確性和檢出限等實驗條件和參數進行驗證，以期建立高效、可靠和準確的生物體中氨基酸單體碳同位素的檢測方法，為氨基酸單體碳同位素在生物地球化學、生態學和生命科學等領域的應用提供技術支撐。

圖1 NPP氨基酸衍生物的衍生化過程Fig.1 The derivatization of NPP amino acid esters

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

QP2010 氣相色譜-質譜儀（GC-MS，Shimadzu，日本）；Mat253 同位素比值質譜儀（IRMS，Thermo Fisher，美國），串聯Trace GC Ultra 氣相色譜儀、Thermo Finnigan GC-Combustion Ⅲ和Al 1310自動進樣器（Thermo Scientific，美國）；ISOprime100 元素分析儀（EA，Elementar，德國）；Eyela MGS-2200 氮吹儀（Eyela，日本）。

1.2 試劑與材料

15 種氨基酸標準品及內標：丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、纈氨酸（Val）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）、γ-氨基丁酸（GABA，內標）、色氨酸（Trp），購自上海阿拉丁生化科技有限公司；鹽酸、吡啶、氨水、氯化亞砜、新戊酰氯（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；C20烷烴同位素標準物質購自美國印地安那大學穩定同位素中心（δ13CVPDB為-32.35‰）；二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、異丙醇（色譜純，Sigma-Aldrich）。實驗用水均為超純水。

1.3 色譜與質譜條件

1.3.1 GC-MSDB-5MS毛細色譜柱（60 m × 0.25 mm ID，0.25 μm 膜厚）；進樣口溫度：250 ℃；分流進樣，分流比：1∶10；進樣量1 μL；載氣：He氣；載氣流速：1 mL/min；吹掃流量：3 mL/min；升溫程序：起始溫度60 ℃，保持5 min，3 ℃/min 升到220 ℃，最后10 ℃/min 升到300 ℃，保持20 min。EI 離子源：溫度250 ℃；接口溫度：280 ℃；溶劑延遲時間12 min，Scan 模式下質量掃描范圍為：m/z50～450。

1.3.2 GC-C-IRMSDB-5MS 毛細色譜柱（60 m × 0.32 mm ID，0.25 μm 膜厚）；進樣口溫度：280 ℃；不分流進樣；進樣量1 μL；載氣：He 氣；載氣流速：1.5 mL/min；升溫程序：起始溫度60 ℃；15 ℃/min升到130 ℃；3 ℃/min升到220 ℃；最后10 ℃/min升到300 ℃，保持25 min。

實驗流程：NPP 氨基酸酯首先經Trace GC Ultra 氣相色譜儀進行分離，然后經氧化爐（CombustionⅢ）及還原爐將氨基酸單體轉化成 CO2后，進入同位素質譜儀進行碳同位素比值測定。氧化爐為填充氧化銅的陶瓷管，含鉑-鎳催化劑，溫度設為960 ℃。還原爐為填充銅絲的陶瓷管，溫度設為640 ℃。

1.4 樣品處理

1.4.1 氨基酸的提取與純化稱取適量研磨成粉的海參、海藻樣品及氨基酸標準品于聚四氟乙烯悶罐中，加入3 mL 6 mol/L 鹽酸，混勻，向罐內充氮氣 30 s以置換出其中的空氣，密封后在110 ℃恒溫干燥箱內水解24 h。得到的水解液置于100 ℃加熱盤上烘干，再用0.1 mol/L 鹽酸溶解，離心10 min，通過強陽離子交換柱（CNWBOND SCX SPE Cartridge，上海安譜實驗科技股份有限公司）純化氨基酸，用4 mol/L氨水洗脫。

1.4.2 氨基酸的衍生化純化后的氨基酸加入2 mL 1 mol/L 的氯化亞砜（溶于異丙醇），在100 ℃下酯化1 h，產物于60 ℃氮氣下吹干后溶解于200 μL吡啶中，再加入200 μL新戊酰氯后在60 ℃下加熱反應30 min，生成NPP，溶解于2 mL 二氯甲烷中，用3 mL 水萃取3 次，取有機相，加無水硫酸鈉振蕩，然后靜置1 h 除水，離心，有機相在室溫下氮氣吹干，使用正己烷置換溶劑，將混合物逐滴通過硅膠柱（硅膠200～400目，內徑4 mm），用乙酸乙酯洗脫，以去除過量的酰化試劑和其他雜質，洗脫液在室溫下氮氣吹干后溶解于正己烷中，用于樣品氨基酸單體濃度和碳同位素測試。

1.4.3 內標溶液與混標溶液的配制內標溶液配制：稱取適量γ-氨基丁酸，用0.1 mol/L HCl 配制成0.1 mmol/L 的內標儲存液，使用時稀釋至合適濃度。氨基酸混合標準溶液配制：稱取適量氨基酸標準品，用0.1 mol/L HCl配制成1 mmol/L的標準溶液，使用時稀釋至合適濃度。

1.4.4 氨基酸單體標準品及衍生試劑碳同位素標定單個氨基酸標準品及衍生試劑的碳同位素δ13C用EA-IRMS 測定；稱取適量的氨基酸標準品、衍生試劑異丙醇和新戊酰氯用錫箔杯包好，利用EAIRMS行分析，每個樣品平行測定3次。

1.5 數據處理與修正

碳穩定同位素值（δ13C）計算如下：

式中，Rsample為所測樣品中13C 與12C 的豐度之比，Rstandard為國際標準樣品中13C 與12C 的豐度之比，以美國南卡羅來納州白堊紀皮狄組中擬箭石化石作為國際碳同位素標準（PDB），其13C/12C=（11 237.2±90）×10-6，定義其δ13C=0‰。

理論上，目標氨基酸氨基上與氮連接的氫被新戊酰基完全取代，羧基與異丙醇形成酯，由于氨基酸衍生物引入了額外的碳原子，若要得到氨基酸真正的δ13C 值，需對其結果進行修正，根據質量平衡方程，修正計算如下：

其中Δδempirical為氨基酸δ13C 校正系數，δGC-C-IRMS為GC-C-IRMS 的測定值，δpredicted為氨基酸δ13C 理論值，δaa為氨基酸真實δ13C 值，naa為氨基酸所含碳原子數，nderiv-aa為衍生產物總碳原子數，δderiv-aa為衍生產物δ13C 值，nDA為衍生試劑碳原子數，δDA為衍生試劑δ13C 值。根據公式（2）、（3）可計算得到衍生化前氨基酸的δ13C值。

2 結果與討論

2.1 前處理流程優化

氨基酸單體衍生化過程中會發生副反應，產生S2Cl2和磺酸類化合物等，此外吡啶還具有叔胺的某些性質，會與酰鹵反應生成水溶性的鹽（如酰基吡啶鹽）［13］。在氨基的酰化過程中使用吡啶作為溶劑，新戊酰氯作為酰化試劑，反應結束后將生成物溶解于二氯甲烷并加入3 mL 水，得到的色譜圖基線平穩，雜質峰數量明顯減少（見圖2）。表明水洗可有效去除水溶性雜質，提高產物NPP 的純度。故本研究在前處理流程中增加水洗步驟。

圖2 水洗前（A）后（B） GC-MS效果對比圖Fig.2 Comparison of GC-MS effects before（A） and after（B） washing

2.2 氨基酸衍生物的色譜分離及質譜學性質

NPP 衍生化方法中，由于精氨酸不參與反應，組氨酸不穩定，半胱氨酸和胱氨酸反應不完全，本實驗暫不分析精氨酸、組氨酸、半胱氨酸和胱氨酸。此外，由于本文采用酸水解條件（6 mol/L HCl，110 ℃，24 h），導致谷氨酰胺和天冬酰胺分別轉化為谷氨酸和天冬氨酸，因此測定的谷氨酸和天冬氨酸同位素值分別為谷氨酰胺和谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸的和值。

分別進樣單個標準氨基酸衍生物，以確定其保留時間，結果見表2。按照表2選擇各氨基酸的特征離子碎片，對樣品進行定量分析，得到15種氨基酸NPP酯在GC-MS 的標準圖譜（見圖3），結果顯示丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、酪氨酸、色氨酸的分離較好。

圖3 Scan模式下氨基酸衍生物在GC-MS上的色譜圖Fig.3 Chromatogram of amino acid derivatives on GC-MS under scan mode

各氨基酸提取凈化以及衍生化過程中的效率可能存在差異，因此取20 μmol/L的氨基酸標準溶液加入到已知氨基酸含量的海參和海藻樣品中，測定其回收率。結果顯示，各氨基酸單體的平均回收率（AVG）為46.4%～96.3%，標準偏差（σ）為0.01～0.26（見表2），方法的精密度變好。丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸的回收率均大于70.0%。因使用酸水解法，色氨酸與含醛基的化合物（如糖）作用會生成腐黑質，蛋氨酸易被氧化，絲氨酸和蘇氨酸部分被破壞，因此蘇氨酸、蛋氨酸、色氨酸的回收率小于60.0%。

將配制好的氨基酸單體標準溶液稀釋成濃度為1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μmol/L 的混合標準溶液，按照“1.3”色譜條件進行測定，以氨基酸標樣濃度（x，μmol/L）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸（表2）。結果顯示，在1.0～16.0 μmol/L范圍內氨基酸的峰面積與濃度呈良好的線性關系（表2），除天冬氨酸（r2=0.988）與酪氨酸（r2=0.987）外，其它氨基酸的相關系數（r2）均不小于0.990。

2.3 氨基酸標準品及其衍生物碳同位素值

取氨基酸標準品衍生物溶液連續在GC-C-IRMS 進樣測試10 次（色譜圖見圖4），結果顯示15 種氨基酸單體δ13C 值的標準偏差均在0.3‰以內，測試結果的精密度較好；將0.6 ～2.0 mmol/L 的氨基酸標準品衍生物分別進樣3 次，其標準偏差為0.11‰～0.35‰（表3），平均標準偏差為0.23‰，測試結果的精密度好；每5次進樣間隔插入一個C20烷烴國際標準物質進行數據校正，其標準偏差為0.29‰，測試結果的準確性較好。

圖4 NPP氨基酸酯的GC-C-IRMS色譜圖（δ13C）Fig.4 Chromatogram of NPP amino acid ester by GC-C-IRMS（δ13C）

表3 氨基酸標品及其衍生物的碳同位素值（δ13C）Table 3 Carbon isotopic composition（δ13C） of standard amino acids and their derivatives

由于每種氨基酸單體在衍生化過程中均增加不同數量的碳原子（至少增加8 個），導致得到的氨基酸單體衍生物與原氨基酸的δ13C 值存在一定差異；同時在衍生化過程中還產生了一定的同位素分餾，使得實測值與理論值出現一定的偏差。將氨基酸標準品通過EA-IRMS 進行分析，每個樣品平行測定3次，其平均碳穩定同位素值δ13C（AVG）與標準偏差（σ）見表3。將其測定值認為是“真實值”，經實驗驗證，其產生的同位素分餾強度與實驗條件（反應時間、溫度等）及衍生化試劑碳同位素值有關，與原氨基酸單體碳同位素值無關。即在相同實驗條件下，氨基酸單體標樣與樣品氨基酸的校正值Δδ相同［14］，基于已知衍生化試劑和氨基酸衍生物的δ13C 值，可依據公式（2）、（3）對得到的校正值進行修正，以求出原氨基酸的碳同位素值。

2.4 氨基酸單體進樣量對碳同位素的影響

氨基酸單體的進樣量對其δ13C值的測定精度有一定的影響，進樣量過高且超過色譜柱的柱容量時，會導致保留時間相近的氨基酸不能實現基線完全分離或不完全氧化為CO2；進樣量過低時氨基酸單體轉化為CO2的量較少，離子源產生的［12C16O16O］+質荷比m/z44的信號值較小，達不到積分要求或相對儀器本底信號過低，影響氨基酸單體δ13C 值的測定精度。為確定合適的進樣量范圍，取0.2 ～2.0 mmol/L的氨基酸衍生物標準品進行測定，每個濃度樣品平行測定3 次，以氨基酸單體的進樣量為橫坐標（x），以質荷比m/z44的信號峰高為縱坐標（y）進行線性回歸，得到線性方程。結果顯示在0.6～2.0 nmol進樣量范圍內，絕大多數氨基酸的進樣量與信號強度的相關系數大于0.99，即質荷比m/z44 信號在300～10 000 mV 間，氨基酸的進樣量與峰高呈良好的線性關系，GC-C-IRMS 系統能將氨基酸衍生物中的碳完全燃燒氧化為CO2，避免了樣品中氨基酸含量差異的影響。此外，當多數氨基酸單體的進樣量小于0.6 nmol時，其δ13C測定值的平均誤差均大于±1‰，而進樣量大于0.6 nmol時，15種氨基酸的測定值分別為（-28.56±0.20）‰、（-30.63±0.26）‰、（-26.33±0.18）‰、（-32.96±0.23）‰、（-27.67±0.21）‰、（-26.67±0.25）‰、（-30.70±0.30）‰、（-33.64±0.24）‰、（-32.86±0.24）‰、（-33.20±0.29）‰、（-26.75±0.28）‰、（-24.44±0.23）‰、（-24.79±0.25）‰、（-31.08±0.26）‰、（-23.42±0.20）‰（以出峰時間為序），其中測試誤差最大的為天冬氨酸（±0.30‰），最小的為纈氨酸（±0.18‰），平均誤差為±0.24‰。可見GC-C-IRMS 系統在進樣量大于0.6 nmol 時能實現對混合體系中氨基酸單體δ13C 值的精準測定（圖5）。因此，為確保氨基酸均能實現完全基線分離，同時滿足GC-C-IRMS 的測試準確度，進行實際樣品測試時應選擇合適的進樣量［15］。

圖5 GC-C-IRMS測定氨基酸進樣量與δ13C值的相關性Fig.5 Correlation between amino acid injection amount and δ13C by GC-C-IRMS

2.5 海參及海藻氨基酸單體含量和碳同位素分析

將海參和海藻兩種生物樣品按照“1.4.1”和“1.4.2”步驟進行氨基酸的提取、凈化和衍生化，氨基酸NPP衍生物通過GC-MS進行定量分析，得到各氨基酸的含量。結果顯示，各氨基酸的含量占比與文獻報道相近［16］。同時采用GC-C-IRMS對氨基酸單體衍生物的碳同位素組成進行測試和校正，每個樣品平行測定3次，結果顯示所有氨基酸單體δ13C值的標準偏差（σ）均不大于0.33‰，海參中各氨基酸單體的δ13C 值為-31.10‰～-8.58‰，海藻中各氨基酸單體的δ13C 值為-30.53‰～-13.76‰（表4）。兩種樣品氨基酸單體的碳同位素值測試結果均在正常范圍內［17-18］，滿足其測試精度的要求。

表4 海參及海藻氨基酸含量和碳穩定同位素值Table 4 Protein amino acid content and carbon stable isotope analysis of sea cucumber and seaweed

實驗結果也表明，不同生物及其體內不同氨基酸的碳同位素值存在差異。這些差異可進一步用于生態系統中碳循環和食物網、生物代謝和營養生態學、全球氣候變化和古氣候重建等方向的研究。

3 結 論

本研究通過優化海參和海藻中的氨基酸提取、純化和衍生化流程，建立了同時測定生物體中15種氨基酸單體濃度及其碳同位素值的方法，各氨基酸的線性關系良好。本方法的衍生產物穩定，適用氨基酸種類多，色譜分離效果好，但由于引入了額外碳原子，需要進行碳同位素的校正。結果表明，各氨基酸單體δ13C 值的測試結果精密度好，檢出限低，各氨基酸濃度與其m/z44信號值的線性關系良好。該方法可以高效、準確地測試生物體中氨基酸單體碳同位素組成，為氨基酸單體同位素技術在生物地球化學、生態學和生命科學等領域的應用提供有力支持。