黃色短桿菌中L-異亮氨酸同位素豐度及分布的分析方法研究

趙雅夢(mèng)，范若寧，雷 雯*

（1.上海化工研究院有限公司，上海 200062；2.上海市穩(wěn)定同位素檢測(cè)及應(yīng)用研發(fā)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200062）

利用同位素標(biāo)記技術(shù)將化合物中普通原子替換為同位素核素所合成的穩(wěn)定同位素標(biāo)記化合物，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，已在蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、生物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)、臨床診斷等生命科學(xué)研究中發(fā)揮重要作用［1-4］。13C、15N標(biāo)記賴氨酸、精氨酸等是細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)（SILAC）中必備的關(guān)鍵試劑［5-6］，也是代謝流量分析中的常用示蹤劑［7-8］。微生物發(fā)酵法是同位素標(biāo)記氨基酸的主要合成方法，將培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)組分替換為穩(wěn)定同位素標(biāo)記化合物，經(jīng)微生物發(fā)酵、提純等即可得到同位素標(biāo)記氨基酸［9-10］。同位素豐度是穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸產(chǎn)品的重要參數(shù)之一，決定了批次產(chǎn)品的質(zhì)量水平，也是穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸在蛋白質(zhì)定量、代謝流等下游應(yīng)用研究中的重要考察指標(biāo)。高豐度穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸產(chǎn)品的應(yīng)用需求大，對(duì)試劑質(zhì)量要求也較高。

目前，氣體同位素質(zhì)譜法和有機(jī)質(zhì)譜法是同位素豐度分析的兩種重要方法，前者通過(guò)高溫燃燒等方式將C、N元素轉(zhuǎn)化為CO2和N2，適用于檢測(cè)純度較高的同位素試劑［11］。后者則是基于化合物同位素質(zhì)量數(shù)的差異完成豐度計(jì)算，如上海化工研究院開(kāi)發(fā)的基于“質(zhì)量簇”的有機(jī)質(zhì)譜同位素豐度［12-13］。近年來(lái)，高分辨質(zhì)譜儀因具有超高分辨率、高靈敏度等特點(diǎn)成為同位素豐度和分布分析的主流工具。研究人員利用高分辨質(zhì)譜儀建立了針對(duì)氘標(biāo)記化合物［14］、13C標(biāo)記葡萄糖［15］等的同位素分布及豐度檢測(cè)方法，可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣本中化合物的豐度計(jì)算，生產(chǎn)過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)控，以及有效的降低成本等明顯優(yōu)勢(shì)。

本研究基于同位素標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化及對(duì)樣品濃度、質(zhì)譜掃描次數(shù)等影響因素的考察，建立了一種穩(wěn)定、準(zhǔn)確的氨基酸同位素豐度計(jì)算方法，實(shí)現(xiàn)了L-異亮氨酸產(chǎn)生菌黃色短桿菌發(fā)酵液中氨基酸同位素豐度及分布分析，可為發(fā)酵反應(yīng)條件優(yōu)化、細(xì)菌代謝機(jī)理研究等提供數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Orbitrap Exploris 120高分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Thermo Fisher 科技有限公司）；MAT 271 型氣體同位素質(zhì)譜儀（美國(guó) Finnigan 質(zhì)譜公司）；XPE105DR 電子天平儀（瑞士Mettler Toledo 集團(tuán)）；Vortex-5渦旋儀（中國(guó)其林貝爾儀器制造有限公司）；Merck-Milipore SimolicityTM超純水系統(tǒng)（德國(guó)Merck公司）。

葡萄糖-13C6（純度為99%，美國(guó)劍橋?qū)嶒?yàn)室）；L-谷氨酸-15N、L-異亮氨酸-15N、L-亮氨酸-15N、L-賴氨酸-15N、L-苯丙氨酸-15N、L-脯氨酸-15N、L-蘇氨酸-15N、L-纈氨酸-15N（純度均＞99%，上海化工研究院有限公司）；甲醇、甲酸、乙腈（ACN）（色譜純，美國(guó)Thermo Fisher科技有限公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取1.0 mg 氨基酸樣品，加入1 mL 50%甲醇水溶液，渦旋30 s 充分混勻，配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取適量?jī)?chǔ)備液，以50%甲醇水溶液稀釋成0.1、0.2、0.5、0.8、1、2 μg/mL的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。儲(chǔ)備液和工作標(biāo)準(zhǔn)溶液均保存于4 ℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：Hypersil Gold Vanquish 色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A 為超純水，流動(dòng)相B 為含0.1%甲酸的甲醇溶液；洗脫條件：90% B 等度洗脫5 min；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件離子源：ESI；電噴霧電壓（Ion sray voltage）：3 200 V；鞘氣（Sheath gas）：20 arb（～2.68 L/min）；輔助氣（Aux gas）：15 arb（～14.03 L/min）；離子傳輸管溫度：320 ℃；掃描模式：全掃描（Full scan）模式下正離子掃描；分辨率：12 000；掃描質(zhì)荷比范圍：70～500m/z。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)

L-異亮氨酸產(chǎn)生菌菌種為黃色短桿菌（Brevibacterium flavum），發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：12 g/L 葡萄糖，3 g/L（NH4）2SO4，0.5 g/L 玉米漿，0.1 g/L K2HPO4，0.025 g/L MgSO4，0.02 g/L FeSO4，0.02 g/L MnSO4，0.01 g/L VB1，0.01 g/L 生物素，pH 7.2。菌種活化、培養(yǎng)及分離純度等過(guò)程參照文獻(xiàn)進(jìn)行［10］。L-異亮氨酸-15N 發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，將（NH4）2SO4替換為（15NH4）2SO4；13C同位素示蹤研究時(shí)，將發(fā)酵培養(yǎng)基組分中的葡萄糖換為20%葡萄糖 -13C6和80%葡萄糖。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

色譜柱是液相色譜的核心，由于本文只針對(duì)L-異亮氨酸進(jìn)行分析，且采用的是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，因此選擇高穩(wěn)定性和重現(xiàn)性的C18色譜柱進(jìn)行分析。分別以乙腈-水、甲醇-水作為流動(dòng)相考察了L-異亮氨酸-15N 的保留及色譜峰形情況。由圖1 可知，以乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，樣品在0.8 min 出峰，且在1 min 左右有雜峰出現(xiàn)。而更換流動(dòng)相為甲醇后，由于甲醇洗脫能力弱于乙腈，保留時(shí)間略有延后，但峰形顯著變好，因此選擇甲醇-水流動(dòng)相體系。在甲醇中加入0.1%甲酸時(shí)，信號(hào)響應(yīng)有所提高，這可能是因?yàn)樗嵝詶l件促進(jìn)了氨基酸的電離。因此最佳流動(dòng)相條件選擇以水為A 相，含0.1%甲酸的甲醇為B相。

圖1 不同流動(dòng)相條件下L-異亮氨酸-15N的提取離子流圖Fig.1 Extracted ion chromatograms（EIC） of L-isoleucine-15N under different mobile phase conditions

為保證待測(cè)物具有良好的質(zhì)譜響應(yīng)，對(duì)離子化模式和噴霧電壓、鞘氣及輔助氣等離子源參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。L-異亮氨酸含有羧基和氨基官能團(tuán)，在正、負(fù)離子模式下均出峰且信號(hào)響應(yīng)較好，本文參照文獻(xiàn)選擇正離子模式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［16］。電離電壓等離子源參數(shù)優(yōu)化可有效提高待測(cè)物的信號(hào)響應(yīng)和檢測(cè)靈敏度。研究顯示，噴霧電壓的提高可增強(qiáng)L-異亮氨酸-15N 的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)，但過(guò)高電壓可能會(huì)發(fā)生源內(nèi)裂解而影響同位素豐度的計(jì)算，因此選擇3 200 V 為最佳噴霧電壓。進(jìn)一步考察鞘氣和輔助氣的影響，結(jié)果顯示鞘氣和輔助氣分別為20 arb（～2.68 L/min）和15 arb（～14.03 L/min）時(shí)，待測(cè)物的響應(yīng)信號(hào)最佳。

2.2 同位素豐度計(jì)算的影響因素

當(dāng)同位素標(biāo)記化合物的相對(duì)同位素偏差大于儀器質(zhì)量偏差時(shí)，可直接參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行同位素豐度計(jì)算［17］，如13C、D 標(biāo)記的化合物均可根據(jù)LC-HRMS 的質(zhì)譜圖進(jìn)行豐度計(jì)算。以L-異亮氨酸-15N 為例，計(jì)算得到L-異亮氨酸-15N的同位素偏差為45 ppm，遠(yuǎn)大于儀器質(zhì)量偏差（5 ppm），因此可直接根據(jù)質(zhì)譜峰強(qiáng)度進(jìn)行豐度計(jì)算。

2.2.1 樣品濃度的影響當(dāng)L-異亮氨酸-15N濃度過(guò)低時(shí)，存在背景干擾大、部分同位素標(biāo)記形式低于閾值而無(wú)法檢出等情況；然而樣品濃度過(guò)高時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致質(zhì)譜殘留而影響后續(xù)使用。本實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度（0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg/mL）L-異亮氨酸-15N 標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)樣品濃度較低時(shí)，測(cè)得的豐度較低且偏差較大。隨著樣品濃度的提高，同位素豐度逐漸提高，在1 μg/mL及以上濃度時(shí)趨于穩(wěn)定（見(jiàn)圖2）。因此后續(xù)采用1 μg/mL樣品濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同濃度下L-異亮氨酸-15N的同位素豐度計(jì)算結(jié)果Fig.2 Isotopic abundances of L-isoleucine-15N at different concentrations

2.2.2 同位素豐度計(jì)算依據(jù)同位素豐度是依據(jù)質(zhì)譜圖中不同標(biāo)記形式化合物的信號(hào)響應(yīng)進(jìn)行計(jì)算［13-18］，目前多以質(zhì)譜峰強(qiáng)度和峰面積進(jìn)行計(jì)算［19］。考察了這兩種計(jì)算形式下同一樣品的同位素豐度，結(jié)果顯示根據(jù)峰面積計(jì)算得到的同位素豐度為98.66%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.03%；根據(jù)峰強(qiáng)度計(jì)算得到的同位素豐度為98.67%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04%。二者基本一致，說(shuō)明對(duì)于高豐度同位素標(biāo)記化合物，采用峰面積或峰強(qiáng)度均可得到較為準(zhǔn)確的計(jì)算結(jié)果。但由于采用峰強(qiáng)度計(jì)算時(shí)只需對(duì)一定數(shù)量質(zhì)譜圖進(jìn)行疊加，使用峰面積時(shí)需對(duì)不同形式的峰面積進(jìn)行積分，相對(duì)復(fù)雜。因此后續(xù)以峰強(qiáng)度進(jìn)行豐度計(jì)算。

2.3 不同檢測(cè)方法對(duì)比

氣體同位素質(zhì)譜法是同位素豐度測(cè)定的常用方法，也是同位素試劑質(zhì)量控制的重要手段之一。本文以L-谷氨酸-15N、L-賴氨酸-15N 等多種15N 標(biāo)記氨基酸為例，對(duì)比了氣體同位素質(zhì)譜法（GIMS）與LCHRMS兩種方法計(jì)算結(jié)果的差異。如表1所示，兩種計(jì)算方法得到的同位素豐度值差值均在0.6%以內(nèi)，LC-HRMS 計(jì)算得到的豐度值普遍高于GIMS 的結(jié)果，這可能是由于兩種檢測(cè)方法原理不同所致。與GIMS 法相比，LC-HRMS 法所需樣品量少，且無(wú)需氣體轉(zhuǎn)化等前處理，操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，有望成為一種高通量、準(zhǔn)確的穩(wěn)定同位素試劑質(zhì)量控制方法。

表1 GIMS及LC-HRMS的氨基酸15N同位素豐度測(cè)定結(jié)果對(duì)比Table 1 Comparison of 15N isotope abundance measurements between GIMS and LC-HRMS in isotope labeled amino acid

2.4 方法應(yīng)用

生物發(fā)酵法是國(guó)內(nèi)制備15N 標(biāo)記氨基酸的主要方法，采用GIMS 進(jìn)行豐度分析時(shí)，需要得到氨基酸純品后再進(jìn)行分析，若試劑產(chǎn)品質(zhì)量不合格則需重新進(jìn)行培養(yǎng)、純化等步驟。而基于LC-HRMS 的豐度分析方法簡(jiǎn)便快捷，雜質(zhì)干擾小，可直接對(duì)菌液進(jìn)行分析。以L-異亮氨酸-15N 產(chǎn)生菌黃色短桿菌菌液為例，在發(fā)酵過(guò)程中，可能存在賴氨酸等雜質(zhì)干擾，如圖3 所示，盡管菌液成分復(fù)雜，但L-異亮氨酸-15N的提取離子流圖信號(hào)響應(yīng)很高，經(jīng)計(jì)算得到15N同位素豐度為98.58%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.03%。

圖3 L-異亮氨酸-15N產(chǎn)生菌黃色短桿菌菌液的離子流圖（A）和質(zhì)譜圖（B）Fig.3 EIC chromatograms（A） and MS spectra（B） of L-isoleucine-15N producing bacteriophage of Brebvibacterium flavum

將該方法進(jìn)一步用于13C6-葡萄糖示蹤的黃色短桿菌中同位素分布及豐度分析，在4～72 h 等不同時(shí)間點(diǎn)取樣（見(jiàn)表2）。結(jié)果顯示，隨著示蹤時(shí)間的增加，L-異亮氨酸-15N 的同位素豐度逐漸升高，48 h后基本達(dá)到平衡，同位素豐度值約為19 atom %13C，與培養(yǎng)基中同位素試劑的添加比例一致，同位素分布如圖4 所示。除同位素豐度計(jì)算外，基于本方法得到的同位素分布也可為代謝流分析、細(xì)菌代謝機(jī)理闡明等研究提供基礎(chǔ)。

表2 不同示蹤時(shí)間下13C標(biāo)記異亮氨酸的同位素豐度Table 2 Isotope abundance of 13C6-isoleucine within different tracing time

圖4 不同示蹤時(shí)間下13C標(biāo)記異亮氨酸的質(zhì)量分布圖Fig.4 Isotope abundance of 13C labeled isoleucine within different tracing time

3 結(jié) 論

本研究建立了一種可用于L-異亮氨酸同位素分布及豐度分析的LC-HRMS 檢測(cè)方法。方法準(zhǔn)確可靠，穩(wěn)定性良好，且所需樣品量少，操作簡(jiǎn)便，尤其適用復(fù)雜生物樣品如細(xì)菌發(fā)酵液中L-異亮氨酸同位素豐度與分布的快速檢測(cè)，可為工程菌株設(shè)計(jì)、培養(yǎng)體系篩選等科學(xué)研究提供支持，提高穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸產(chǎn)品的產(chǎn)量，助力生命科學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展。