分散固相萃取/熒光檢測法選擇性富集和定量人體血漿中的α-細辛醚

唐 芃，劉 鐵，劉德龍*

（1.河北師范大學 化學與材料科學學院，河北 石家莊 050024；2.西北師范大學 化學化工學院，甘肅 蘭州 730070）

由于蛋白質基質的干擾，對復雜生物樣品中的中藥進行檢測較為困難［1-2］，導致對此類樣品中中藥的微量活性成分進行定量存在挑戰。為了從復雜樣品中得到滿足檢測要求的目標分析物，研究人員開發了多種預處理方法，其中固液萃?。?］、液液萃?。?-5］和固相萃?。⊿PE）是目前最常用的樣品預處理方法。分散固相萃取（dSPE）是一種操作更簡單的固相萃取方法，該方法通過將吸附劑直接分散在含有分析物的液體樣品中，待吸附劑從樣品溶液中分離出來后，再選擇合適的溶劑將目標分析物從吸附劑中洗脫出來［6］。與其他預處理方法相比，分散固相萃取法使用的溶劑更少，萃取效率高，吸附劑種類選擇廣泛［7］。

共價有機框架（COFs）是一類新型晶態有機多孔聚合物，由有機構筑單元通過輕元素（C、O、N、H 等）的強共價鍵構建并通過縮聚反應合成［8］。其多孔結構可以提供高孔隙率和較大的表面積，且其豐富的活性位點［9］使之可與目標分析物充分作用，提高識別靈敏度，同時COFs熱穩定性良好［10］，是一種理想的dSPE 吸附劑［11］。近年來，利用COFs 作為吸附劑分離和富集物質的研究顯著增加［12-14］，因此，COFs有望成為中藥活性成分的有效吸附劑。

α-細辛醚是一種存在于多種植物中的天然苯丙烯，具有廣泛的藥理活性，已被用于食品調味和包括癲癇［16］、高血脂［17］和呼吸系統疾病［18］等在內的疾病治療［15］。一些涉及藥代動力學、藥效學和藥毒理學的研究需要對血漿、尿液和其他生物體液中的微量藥物進行分析［19-20］，由于α-細辛醚在實際樣品中的含量較低，且易受雜質干擾，因此在樣品預處理后選擇合適的檢測方法進行定量分析十分必要。目前利用COFs 富集后再進行檢測的方法主要有色譜法［21-23］、質譜法［24］和色譜-質譜聯用法［25-28］。色譜法的樣品前處理繁瑣耗時，而光譜技術因靈敏度高、穩定性好和響應速度快受到廣泛關注，且光譜法能減少有害化學溶劑的使用，更為環保［29-30］。熒光檢測法作為一種更快、更高效的方法，可用于中藥有效成分的定量研究，因此本文選用熒光法對α-細辛醚進行檢測和分析。

首先基于1，3，5-三甲酰基間苯三酚和3，3′-二甲基聯苯胺的席夫堿反應合成了共價有機框架TpBD-Me2（COF-TpBD-Me2），以其作為吸附劑選擇性吸附人體血漿中的α-細辛醚，并優化了吸附條件，通過吸附等溫線和吸附動力學研究闡明了吸附機理。最后，利用熒光光譜對人體血漿中的α-細辛醚進行定量分析。該方法有望應用于生物樣品中小分子藥物的富集和定量分析。實驗過程如圖1所示。

圖1 COF-TpBD-Me2從人體血漿中提取α-細辛醚并熒光檢測的步驟Fig.1 Steps of COF-TpBD-Me2 for extracting and fluorescence detection of α-asarone from human plasma

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

S-4800 型掃描電子顯微鏡（SEM）、H-7650 型透射電子顯微鏡（TEM）（日本Hitachi 有限公司）；Thermo SCIENTIFIC 型傅里葉紅外光譜分析儀（FT-IR，美國Thermo 有限公司）；SmartLab X 射線衍射儀（XRD，日本Rigaku 有限公司）；Autosorb IQ-MP 全自動比表面和孔徑分布分析儀（美國安東帕公司）；STA449F3 同步熱分析儀（德國Netzsch 有限公司）；AUY220 電子分析天平（日本島津有限公司）；TGL-18-B型高速離心機（湖南星科科學儀器有限公司）；SHZ-82型搖床（中國江蘇金壇正榮實驗儀器廠）。

FS5 分子熒光光譜儀（英國愛丁堡儀器公司），激發波長為265 nm，發射波長為365 nm，發射光譜在305～400 nm范圍內以1 nm間隔測量，激發狹縫和發射狹縫均設置為1 nm。

1.2 材料與試劑

α-細辛醚標準品（純度≥98%）購自阿拉丁化學有限公司；1，3，5-三甲酰基間苯三酚（Tp）、3，3′-二甲基聯苯胺（BD-Me2）、對甲基苯磺酸（PTSA）均購自泰坦科技有限公司；N，N-二甲基乙酰胺（DMAC）購自致遠化學試劑有限公司；丙酮和乙腈均購自大茂化學試劑廠。所有試劑均為分析純，所有水溶液均由蒸餾水配制。無藥人體血漿由河北省醫院提供。

1.3 COF-TpBD-Me2的合成

COF-TpBD-Me2根據已有方法合成［31］。首先，將PTSA（2.5 mmol，475.5 mg）和BD-Me2（0.45 mmol，95.5 mg）加入到Tp（0.3 mmol，63 mg）和100 μL 水中，將混合物研磨5 min。隨后轉移至玻璃瓶中，于170 ℃烘箱中加熱60 s，依次用水、DMAC 和丙酮清洗數次以除去PTSA 和殘留的分子雜質，真空干燥得到深紅色粉末。合成路線如圖2所示。

圖2 COF-TpBD-Me2合成路線Fig.2 Synthesis route of COF-TpBD-Me2

1.4 樣品溶液的配制

準確稱取α-細辛醚標準品溶解于10 mL甲醇中，配制成2 mg/mL的儲備液并于4 ℃下保存。將儲備液加入磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）中，配制α-細辛醚質量濃度為1、5、15、25 μg/mL的樣品溶液。

1.5 分散固相萃取實驗

稱取2 mg COF-TpBD-Me2置于5 mL 離心管中，加入2 mL 樣品溶液超聲5 min 混合均勻，在搖床上以180 r/min吸附30 min后以10 000 r/min離心5 min，棄去上清液，于室溫干燥，并用2 mL乙腈洗脫60 min，洗脫液經離心分離后用于熒光檢測。

2 結果與討論

2.1 COF-TpBD-Me2的表征

合成的COF-TpBD-Me2表面粗糙，其SEM 圖像如圖3A 所示。TEM 圖像（圖3B）顯示，COF-TpBDMe2呈絲狀。COF-TpBD-Me2紅外光譜曲線中Tp 的C=O 鍵（1 644 cm-1）和BD-Me2的N—H 伸縮帶（3 300～3 500 cm-1）消失（圖4A），表明原始材料已完全消耗。1 240 cm-1（C—N）和1 580 cm-1（C=C）處強烈的吸收峰表明β-酮烯胺連接框架結構形成。圖4B為合成的COF-TpBD-Me2的XRD結果，在～3.64°處的強峰屬于（100）面，～6.42°，～9.16°，～26.12°處的衍射信號分別對應（200）、（210）和（001）晶面。合成的共價有機框架與已有報道結果吻合良好［10］。

圖3 COF-TpBD-Me2的掃描電鏡圖（A）和透射電鏡圖（B）Fig.3 SEM image（A） and TEM image（B） of COF-TpBD-Me2

圖4 Tp，BD-Me2和COF-TpBD-Me2的紅外光譜圖（A）以及 COF-TpBD-Me2的X射線衍射圖（B）、N2吸附-解吸等溫線（C）、熱重分析曲線（D）Fig.4 FT-IR spectra of Tp，BD-Me2 and COF-TpBD-Me2（A），XRD pattern（B），N2 adsorption-desorption isotherm（C），and TGA curve of COF-TpBD-Me2（D）

N2吸附-解吸等溫線（圖4C）顯示，活化后的COF-TpBD-Me2呈可逆的Ⅰ型吸附等溫線，比表面積（BET）為172.19 m2/g。COF-TpBD-Me2的熱重分析（TGA）曲線如圖4D 所示，500 ℃以上由于框架分解，COF-TpBD-Me2的重量減少40%。

2.2 dSPE的條件優化

2.2.1 吸附劑質量濃度所有吸附優化實驗均在α-細辛醚質量濃度為25 μg/mL 的樣品溶液中進行，每個實驗平行測定3次。如圖5A所示，當吸附劑質量濃度從0.3 mg/mL增加到0.9 mg/mL時，α-細辛醚的吸附率逐漸增加；隨著吸附劑質量濃度的繼續增加，在0.9 ～1.1 mg/mL 范圍內，α-細辛醚的吸附率變化不明顯。因此，后續實驗采用吸附劑質量濃度為0.9 mg/mL。

圖5 吸附劑質量濃度（A）、吸附時間（B）、pH值（C）、解吸試劑（D）、解吸時間（E）的優化Fig.5 Optimization of mass concentration of adsorbent（A），adsorption time（B），pH value（C），desorption solvent（D） and desorption time（E）

2.2.2 吸附時間吸附效率與吸附時間有關［32］，因此考察了吸附時間（10～180 min）對吸附效率的影響。如圖5B 所示，在10～30 min 內，α-細辛醚的吸附率逐漸增加，30～180 min 時吸附效率趨于穩定。因此選擇30 min為最佳吸附時間。

2.2.3 pH值考察了樣品pH值（3.0～11.0）對α-細辛醚吸附率的影響。從圖5C可以看出，pH值對α-細辛醚的吸附影響不大，pH 3.0～11.0 條件下的吸附效率均在90%以上。因此，在后續實驗中不調整樣品溶液的pH 值。α-細辛醚的吸附效率不受pH 值影響，可能是因為其在堿性條件下發生了去質子化反應［33］，目標分析物與COF-TpBD-Me2之間產生了靜電相互作用。

2.2.4 解吸試劑分別考察了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和四氫呋喃5 種有機溶劑作為解吸試劑的效果。如圖5D 所示，在相同的吸附和解吸條件下，乙腈的解吸效率最高。因此，使用乙腈作為解吸試劑。

2.2.5 解吸時間在10～120 min 內進行解吸實驗，如圖5E 所示，60 min 時解吸效率達95%。為節省時間和提高效率，選擇后續實驗的解吸時間為60 min。

2.3 COF-TpBD-Me2中α-細辛醚的吸附等溫線

為考察COF-TpBD-Me2對α-細辛醚的最大吸附能力，對不同質量濃度（25～300 μg/mL）的α-細辛醚進行吸附等溫實驗。如圖6 所示，隨著α-細辛醚質量濃度的增加吸附量逐漸增加，在質量濃度250 μg/mL 時基本達到吸附平衡。根據公式（1）計算得COF-TpBD-Me2對α-細辛醚的最大吸附容量為214.77 mg/g。高吸附容量可歸因于吸附劑的高比表面積，豐富的結合位點以及氫鍵、范德華力和π-π 鍵等相互作用。平衡吸附量（Qe，mg/g）計算公式如下：

圖6 α-細辛酮在COF-TpBD-Me2上的吸附等溫線Fig.6 Adsorption isotherm of α-asarone on COFTpBD-Me2

式中，C0為初始濃度，Ce為平衡濃度，m為吸附劑質量，V為溶液體積。

此外，為了確定可準確描述COF-TpBD-Me2吸附過程的合適模型，使用Langmuir（公式（2））和Freundlich（公式（3））模型對等溫線數據進行擬合。

式中，Qe為平衡吸附量，Qm為最大吸附量，Ce為平衡溶液中α-細辛醚的濃度；KL和KF分別為朗繆爾常數和弗倫德里希常數，n為吸附劑的吸附親和力。

表1 為根據兩種模型計算所得到的參數，圖7 為兩種模型對吸附等溫線的擬合圖。結果表明，Langmuir 模型的相關系數（r2）大于Freundlich 模型。Langmuir 模型被廣泛用于模擬單層吸附過程，而Freundlich 模型主要用于描述多層吸附過程。該結果表明α-細辛醚在COF-TpBD-Me2上為單層吸附過程，且吸附的α-細辛醚具有均勻的結合位點，吸附能相等，吸附物質之間沒有相互作用［34］。

表1 COF-TpBD-Me2對α-細辛醚的吸附等溫線參數Table 1 Adsorption isotherm parameters of α-asarone on COF-TpBD-Me2

圖7 Langmuir（A） 和 Freundlich（B） 模型擬合吸附等溫線Fig.7 The fitting adsorption isotherms by Langmuir （A） and Freundlich （B） models

2.4 吸附動力學實驗

對α-細辛醚在COF-TpBD-Me2上的吸附動力學進行分析，確定吸附平衡時間。如圖8 所示，吸附容量在最初的30 min內迅速增加，之后吸附容量無明顯變化，說明吸附達到平衡。快速的吸附速率可歸因于COF-TpBD-Me2較大的比表面積和孔隙率。采用擬一級和擬二級動力學模型對實驗數據進行擬合，以考察α-細辛醚在COF-TpBD-Me2上的吸附行為。兩種模型公式如公式（4）和公式（5）所示：

圖8 α-細辛醚在COF-TpBD-Me2上的吸附動力學曲線Fig.8 Adsorption kinetic curve of α-asarone on COF-TpBD-Me2

式中，Qe為平衡吸附量，Qt為α-細辛醚在t時刻的吸附量，t為吸附時間，K1為擬一級吸附速率常數，K2為擬二級吸附速率常數。

由擬一級（K1=0.011 min-1，r2=0.657）和擬二級（K2=0.009 g·mg-1·min-1，r2=0.999）動力學模型擬合結果可知，擬二級動力學模型的相關系數（r2）更大更適合描述α-細辛醚在COF-TpBD-Me2上的吸附過程。由于擬一級動力學模型一般適用于速度較快的吸附過程，擬二級動力學模型更適合復雜、多步的吸附過程［35-36］，因此α-細辛醚在COF-TpBD-Me2上的吸附是復雜多步過程。

2.5 方法驗證

在最佳條件下，考察了熒光光譜法測定α-細辛醚的線性關系。結果顯示，α-細辛醚在0.1～10 μg/mL 范圍呈良好的線性關系，線性方程為y=2 849x+2 100（r2＞0.999），其中y為熒光強度，x為α-細辛醚的質量濃度（μg/mL）。分別按照IUPAC標準計算檢出限（LOD，3σ）和定量下限（LOQ，10σ），得到α-細辛醚的LOD為0.002 5 μg/mL，LOQ為0.008 4 μg/mL。

通過在1 d 內連續測定標準溶液6 次計算日內相對標準偏差（RSD），通過在3 d 內每天測定標準溶液3次計算日間RSD，得到日內和日間RSD分別為2.0%和5.4%。

2.6 實際樣品測定

向“1.4”部分制備的α-細辛醚樣品溶液中加入人體血漿，并在最佳條件下進行吸附實驗，檢測洗脫液的熒光發射光譜。如圖9曲線a和曲線b所示，人體血漿的發射波長與α-細辛醚相近（λEM，α-細辛醚=365 nm，λEM，人體血漿=330 nm），導致在實際樣品中很難通過發射波長對兩者進行區分，同時α-細辛醚的熒光強度也會受到人體血漿的影響（圖9 曲線c）。對人體血漿進行吸附實驗，結果在洗脫液中未檢出血漿的特征光譜（圖9 曲線e），結合圖9 曲線a 和曲線d 進行分析可知，COF-TpBD-Me2能排除人體血漿干擾，選擇性富集和定量分析α-細辛醚。

圖9 α-細辛醚（a）、人體血漿（b）、人體血漿和α-細辛醚混合液（c）、混合液經選擇性吸附后的洗脫液（d）、人體血漿洗脫液（e）的熒光發射光譜Fig.9 The fluorescence spectra of α-asarone（a），human plasma（b），the mixed solution of α-asarone and human plasma（c），eluate of the mixed solusion after selective adsorption（d），and eluate of human plasma after adsorption（e）

為了探究所建方法的實用性，進行樣品加標回收實驗。分別將不同質量濃度（1、5、15 μg/mL）的α-細辛醚加入人體血漿中，進行吸附回收，每個濃度平行進行3 次實驗，結果見表2。結果顯示，樣品的加標回收率為92.2%～98.0%，RSD 小于4.0%。

表2 加標人體血漿中α-細辛醚的回收率和相對標準偏差（n=3）Table 2 Recoveries and RSDs of α-asarone in spiked human plasma（n=3）

為考察實際樣品中α-細辛醚的定量下限，在人體血漿中進行0.1～0.5 μg/mLα-細辛醚加標回收實驗，得到α-細辛醚的回收率為80.7%～98.8%，RSD 為2.7%～5.3%。因此，α-細辛醚在人體血漿中的定量濃度可低至0.1 μg/mL。

2.7 吸附機理分析

通過計算得到α-細辛醚的分子大小為12.122 ? × 9.597 ? × 5.276 ?。人體血漿中含量最高的蛋白質—人血清白蛋白（HSA）的分子大小為80 ? × 80 ? × 30 ?［37］，而COF-TpBD-Me2的孔徑為23 ?［9］。在吸附作用下，COF-TpBD-Me2的固有孔徑使得α-細辛醚分子可在其中進行擴散，但會阻止蛋白質大分子的進入［38］，以此實現對α-細辛醚分子的選擇性吸附。

3 結 論

本文建立了分散固相萃取/熒光檢測法對人體血漿中的α-細辛醚進行定量檢測，以COF-TpBD-Me2為選擇性吸附劑富集人體血漿中微量α-細辛醚，可排除人體血漿對α-細辛醚的熒光干擾，實現α-細辛醚的定量分析。該方法在復雜生物樣品的預處理和定量分析方面具有廣闊的應用前景。