LC-MS/MS結合分子網絡技術快速鑒定生三七和砂燙三七的三萜皂苷類成分

陳興龍，周 堂，白同塵，張海瑩，侯 博，張榮平

（云南中醫藥大學 中藥學院暨云南省南藥可持續利用研究重點實驗室，云南 昆明 650500）

三七為五加科人參屬植物三七（Panax notoginseng（Burkill） F. H. Chen ex C. H.）的干燥根及根莖，為云南省特有的中藥大品種資源。云南省在三七種植、加工和使用方面獨具特色［1］。三七在臨床上有著生熟異用之分，生三七及其制劑主要用于治療心血管疾病，血塞通、血栓通等以三七為主的中成藥已廣泛應用于血栓性疾病治療［2-3］。中醫臨床認為熟三七具有補益功效，可用于改善身體虛弱和氣血虧虛［4-5］。三七的傳統炮制方法為蒸制［6］。本課題組長期致力于三七藥效物質基礎研究，尤其關注生熟三七藥用的差異性。前期研究發現砂燙三七可促使生三七的化學成分發生變化［7］。研究認為，三七經炮制后的化學成分尤其是三萜皂苷類成分變化顯著，由多糖苷降解為單糖苷，可能是造成三七生熟異用、產生不同臨床效果的原因［8-13］。但關于砂燙三七中三七皂苷的轉化情況未見報道，難以為砂燙三七提供合理的質量標準。

質譜分析具有高效靈敏的優勢［14-16］，目前在中藥復雜體系［17-18］、藥物代謝物［19］、環境污染物［20］等分析中應用廣泛。其中，質譜分子網絡（Molecular networking）已成為質譜分析的主要工具［21-22］。其基于相似結構的化合物在同一分析條件下產生相似質譜碎片的原理，借助全球天然產物社會分子網絡（GNPS）平臺，通過計算機算法將質譜碎片按照相似度整合成一張可視化的網絡圖譜進行分析［23］。利用LC-MS/MS 結合分子網絡技術有助于提高復雜質譜數據的解析效率，為中藥成分的深度分析提供科學依據［24］。

本文利用LC-MS/MS結合分子網絡技術對生三七和砂燙三七的三萜皂苷類成分進行快速識別鑒定，根據對照品、保留時間、特征碎片離子、MS/MS裂解規律和文獻報道等信息，從生三七中鑒定出50個三萜皂苷，從砂燙三七中鑒定出60個三萜皂苷，有11個皂苷類成分通過對照品進行驗證。本研究有助于闡明生三七和砂燙三七的三萜皂苷類成分差異，可為三七生熟異用的藥效物質基礎差異研究提供支持，為砂燙三七的質量標準研究提供依據。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

三七于2022 年10 月購自昆明螺螄灣藥材市場，由云南中醫藥大學趙榮華教授鑒定為五加科（Araliceae）植物三七（Panax notoginseng（Burkill））的根莖。對照品人參皂苷CK、F1、F2、F11、Rb1、Rc、Re、Rg1、Rg2、Rg3、Ro、Rh1、Rh2、Rh4、Rk3和三七皂苷R1購自成都植標化純生物科技有限公司，純度大于98%。色譜純乙腈、甲酸和甲醇購于德國默克公司。Agilent 1260 液相色譜儀；Agilent 1290超高效液相色譜-Agilent 6530四極桿飛行時間串聯質譜儀：配有電噴霧雙噴離子源（Dual AJS ESI）及Agilent MassHunter Qualitative Analysis B. 10.0數據處理系統（美國安捷倫科技有限公司）。

1.2 三七的炮制與樣品提取處理

1.2.1 砂燙三七的炮制經分揀且過20目篩的河砂置于鍋內升溫至170～220 ℃；生三七切成厚片，放入河砂中翻炒，河砂、藥材的質量比為30∶1，待藥材呈棕褐色，篩掉砂粒，取出三七片，即得砂燙三七。

1.2.2 三七皂苷的提取與富集將生三七片與砂燙三七片各500 g 打成細粉，分別置于2 500 mL 70%乙醇-水中浸泡過夜，回流提取3次，每次2 h，合并濃縮得到生三七和砂燙三七浸膏各約60 g。兩者浸膏分別取10 g，以100 mL 超純水分散，1 000 mL D101 大孔樹脂柱層析（3 × 20 cm），以水和70%（體積分數）乙醇-水洗脫，收集洗脫流分，即為三七總皂苷部位。將得到的浸膏冷凍干燥成粉，分別記為生三七（A）和砂燙三七（B）總皂苷。

1.2.3 樣品的配制取生三七和砂燙三七總皂苷各10 mg，用甲醇溶解配制為2 mg/mL 的溶液。精密稱取1.0 mg對照品，用甲醇溶解配制為0.25 mg/mL的溶液。根據保留時間的差異，將對照品混合為混合對照樣品，分別為Gs-1組：人參皂苷CK、F1、F11、F2、Re、Rg2；Gs-2組：人參皂苷Rb1、Rg1、Rh4、Ro；Gs-3 組：人參皂苷Rc、Rg3、Rh1、Rh2、Rk3 和三七皂苷R1。以上樣品均離心（10 000 r/min，10 min）后取上清液進行LC-MS/MS分析。

1.3 LC-MS//MS分析及質譜分子網絡構建

1.3.1 色譜條件Agilent C18柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm），流動相：A 為0.05%（體積分數）甲酸水，B 為乙腈，進樣量為 5 μL，流速為0.2 mL/min，柱溫為30 ℃。梯度洗脫條件：0～1 min，5%～15% B；1～40 min，15%～45% B；40～50 min，45%～70% B；50～55 min，70%～90% B；55～60 min，90% B；60～61 min，90%～5% B；61～65 min，5% B。

1.3.2 質譜條件掃描模式為負離子電離模式，干燥氣溫度：320 ℃，干燥氣流速：8 L/min；鞘氣溫度：350 ℃，鞘氣流速：11 L/min；噴嘴電壓：1 000 V；毛細管出口電壓：70 V；毛細管電壓：1 000 V（ESI-）；碰撞能量：10、20、30、40 eV；質譜掃描范圍：m/z100～3 000。參比為嘌呤（Purine）和HP-0921，負離子模式下m/z分別為112.985 6和1 033.988 1。

1.3.3 GNPS 分子網絡采用ProteoWizard 軟件將原始的LC-MS/MS 數據文件轉化成.mzXML 格式的數據文件；將數據文件導入GNPS 平臺，建立分子網絡，母離子之間的最大質量偏差設置為20 mDa，其余參數為默認值；運用Cytoscape 3.9.1軟件使其可視化。

1.4 三萜皂苷的定量分析

基于LC-MS/MS 分析結果，選取人參皂苷Rb1、Rg1、Rg3、Rh4、Rk3和三七皂苷R1作為對照品，采用高效液相色譜法測定生三七和砂燙三七總皂苷中三萜皂苷的含量。色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）。流動相：乙腈（A）和水（B）。梯度洗脫條件：0～20 min，20% A；20～45 min，20%～46% A；45～55 min，46%～55% A；55～60 min，55% A；60～90 min，55%～100% A。檢測波長：203 nm，流速：1.0 mL/min，進樣量10 μL。

混合對照品溶液配制：精密稱取人參皂苷Rb1、Rg1、Rg3、Rh4、Rk3 和三七皂苷R1 適量，加甲醇定容，制成含上述人參皂苷質量濃度依次為1.2、1.9、0.1、0.1、1.5、0.6 mg/mL 的混合對照品。供試品溶液配制：精密稱取A 和B總皂苷各1.0 mg溶于1 mL甲醇中，搖勻即得供試品溶液。以上樣品均經0.45 μm微孔濾膜過濾后，待分析。

分別精密吸取上述混合對照品溶液0.5、1、2、4、8、10 mL，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。按上述色譜條件測定，以進樣量（μg）為x軸，峰面積為y軸進行線性回歸計算。

2 結果與討論

2.1 三萜皂苷的MS/MS裂解行為

為揭示三萜皂苷類成分的質譜裂解方式，對16 種皂苷類成分的MS/MS 裂解行為進行分析。Gs-1、Gs-2和Gs-3三組混合對照品的總離子流圖如圖1所示。分析顯示，三萜皂苷類成分在負離子模式下響應較強，容易檢測到［M-H］-、［M+Cl］-和［M+HCOO］-等加合離子，根據加合離子可確認對照品的分子量和分子式信息。因［M+Cl］-和［M+HCOO］-離子的豐度高，本研究中的母離子主要為［M+HCOO］-離子，少數為［M+Cl］-或［M-H］-離子。

如圖2 所示，三萜皂苷類成分因含有葡萄糖基、鼠李糖基或阿拉伯糖基，在負離子模式下易斷裂得到糖基碎片。如丟失葡萄糖基（Glc）后產生m/z179（C6H11O6） 或m/z161（C6H9O5）碎片，丟失鼠李糖基（Rha）產生m/z143（C6H7O4）碎片，丟失阿拉伯糖基（Ara）則產生m/z149（C5H9O5）碎片。此外，對于單糖取代的皂苷類成分，人參皂苷F1 和人參皂苷CK 丟失C-20 位葡萄糖基后產生m/z179 碎片，伴隨產生m/z119碎片；人參皂苷Rh1和人參皂苷Rh2丟失C-3或C-6位葡萄糖基則直接產生m/z161碎片。C-20取代基較易丟失，故該取代基丟失產生的碎片豐度較高。對于單個葡萄糖基取代的皂苷，化合物極性順序為：6-Glc 取代＞ 20-Glc 取代＞ 3-Glc 取代，故該規律為區別含有C-20、C-3 或C-6 位糖基的皂苷類成分提供了依據。對于含有二糖的皂苷類成分，若為-Glc（2→1）Rha 取代（人參皂苷F11 和人參皂苷Rg2），二糖基丟失產生m/z205（C8H13O6）碎片；若為-Glc（2→1）Glc取代（人參皂苷Rg3），二糖基丟失生成m/z221（C8H13O7）碎片；若為-Glc（6→1）Arab取代（人參皂苷Rc），二糖基丟失生成m/z293（C11H17O9）、m/z191（C7H11O6）碎片。

圖2 三萜皂苷對照品的二級質譜圖Fig.2 MS/MS spectra of triterpenoid saponins

2.2 生三七和砂燙三七中三萜皂苷的快速鑒定

將生三七總皂苷和砂燙三七總皂苷進行LC-MS 分析，獲得總離子流圖（圖3）。進一步進行MS/MS分析，獲得二級質譜圖，將二級質譜數據在GNPS 平臺進行分析，通過Cytoscape 3.9.1 軟件獲得分子網絡可視化圖（圖4）。該分子網絡中每個節點代表一種化合物，相連的節點說明二者之間有共有的離子碎片，分子網絡中箭頭的指向代表相互關聯的兩個化合物節點間可能存在的基團修飾與被修飾關系（如糖基化、酰基化等）。在本研究中對于糖基化等常見的修飾類型，多以低質量化合物為基礎對其進行相應的化學修飾或官能團反應，從而實現對高質量化合物的結構解析和推斷。網絡中數據點間的距離大小（邊距）為相應化合物對應的二級質譜的余弦相似性，網絡中距離較近的兩個節點具有更高的二級質譜相似性，即二者結構的相似性越高。本實驗從生三七中鑒定出50個三萜皂苷，從砂燙三七中鑒定出60 個三萜皂苷，經分析后發現二者共有23 個皂苷類成分；生三七單獨有27 個成分，包括11 個丙二酰基取代的皂苷；砂燙三七單獨含有37 個皂苷，包括19 個乙酰基取代的成分（有1 個未鑒定結構），化合物結構如圖5所示。三萜皂苷類化合物的具體信息見表1。

圖3 生三七（A）和砂燙三七（B）總皂苷的LC-MS/MS總離子流圖Fig.3 TIC of total saponins from Panax notoginseng（A） and processed Panax notoginseng with hot sand（B） by LC-MS/MS the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

圖4 生三七（A）和砂燙三七（B）總皂苷的分子網絡圖及代表性色譜峰的二級質譜圖Fig.4 The molecular network diagram of total saponins from Panax notoginseng（A） and processed Panax notoginseng with hot sand（B） and the MS/MS spectra of characterized peaks

圖5 生三七（A）和砂燙三七（B）中鑒定的三萜皂苷Fig.5 The triterpenoid saponins identified from Panax notoginseng（A） and processed Panax notoginseng with hot sand（B）

三萜皂苷類成分的鑒定一般遵循以下過程：首先，通過研究對照品的質譜裂解行為，歸納總結三萜皂苷的裂解規律，應用于樣品中三萜皂苷的鑒定；其次，對于保留時間和質譜裂解行為與對照品一致的，則將其鑒定為對照品；再次，對于對照品中不包括的三萜皂苷，則依賴質譜分子網絡，找到其相似結構，再分析其質譜裂解行為，進而解析結構。

2.2.1 共有皂苷類成分的鑒定在生三七和砂燙三七中，檢測到共有皂苷類成分23個，其中有11個成分可通過對照品鑒定，分別為人參皂苷F1、F2、Rb1、Re、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh4、Rk3 和三七皂苷R1。以峰B1為例，說明共有皂苷類成分的鑒定過程。在負離子模式下，測得峰B1的［M-H］-為m/z931.523 6，［M+Cl］-為m/z967.501 0，［M+HCOO］-為m/z977.530 5，預測其分子式為C47H80O18，不飽和度為8。三七中三萜皂苷的苷元含有5 個不飽和度，說明該化合物還含有3 個糖，共組成8 個不飽和度。進行MS/MS 分析發現m/z799.482 8（C42H71O14，-2.1（實測值與計算值的誤差，單位為mDa，下同），［M-H-Xyl］-）、769.473 1（C41H69O13，-1.3，［M-H-Glc］-）、637.430 1（C36H61O9，-2.0，［M-HXyl-Glc］-）和475.376 6（C30H51O4，-2.7，［M-H-Xyl-2Glc］-）等碎片，上述碎片均為B1脫去1～3分子糖基碎片所產生，且經高分辨質譜分析，發現這些糖基碎片為兩分子葡萄糖和一分子木糖（Xyl）。另外檢測到m/z179.055 8（C6H11O6，-0.3，［Glc-H］-）、161.044 5（C6H9O5，-1.2，［Glc-H-H2O］-）、149.045 7（C5H9O5，+0.1，［Xyl-H］-）和119.035 1（C4H7O4，+1.1）等碎片，其中m/z179.055 8、161.044 5 和119.035 1的碎片為C-20位丟失Glc后產生，m/z149.045 7碎片與Xyl裂解有關。在分子網絡中，B1與對照品人參皂苷Rg1（B3）高度相關，說明它們結構相似；箭頭由B3指向B1，二者分子量的精確差值表明B1 為B3 的木糖基修飾產物，即B1 較B3 多一分子木糖基取代。進一步檢索數據庫，發現三七皂苷R1的C-20位為Glc 取代、C-6位為Glc（2→1）Xyl取代，與質譜裂解行為相符，與對照品的質譜行為和保留時間也吻合。因此，將B1鑒定為三七皂苷R1。

2.2.2 丙二酰基取代的皂苷類成分的鑒定本研究從生三七中檢測到10 個丙二酰基取代的皂苷類成分，在砂燙三七中未發現。以峰A33 為例說明丙二酰基取代皂苷的鑒定過程。負離子模式下，測得峰A33 ［M-H］-為m/z1 193.594 6，預測其分子式為C57H94O26，不飽和度為11。MS/MS 檢測到的碎片有m/z1 149.603 9（C56H93O24，-2.3，［M-H-CO2］-）、1 107.592 4（C54H91O23，-3.3，［M-H-CO2-C2H2O］-）、1 089.582 1（C54H89O22，-3.0，［M-H-CO2-C2H2O-H2O］-）、945.538 7（C48H81O18，-4.4，［M-H-CO2-C2H2O-Glc］-）、783.486 8（C42H71O13，-4.2，［M-H-CO2-C2H2O-2Glc］-），明顯觀察到因丙二酰基脫去CO2或C2H2O 所產生的碎片，如m/z1 149.603 9 和m/z1 107.592 4，其他脫糖基碎片與對照品人參皂苷Rb1（B20） 的脫糖基碎片類似。這些丙二酰基取代的皂苷類成分往往聚集成簇，并與其他非丙二酰基取代的皂苷因箭頭指向而存在修飾與被修飾的關系，為解析其他丙二酰基皂苷提供了依據。結合數據庫檢索結果，將峰A33確定為6′′-丙二酰人參皂苷Rb1。

（續表1）

（續表1）

2.2.3 乙酰基取代的皂苷類成分的鑒定乙酰基取代的皂苷類成分主要在砂燙三七中發現，本研究從砂燙三七中共發現19個乙酰基取代的皂苷類成分，鑒定了其中的18個。以峰B22為例說明該類皂苷的鑒定過程。負離子模式下，測得峰B22 的［M-H］-1 149.602 1 和［M+HCOO］-1 195.607 9，預測其分子式為C56H94O24，不飽和度為10。MS/MS 測定其碎片為m/z1 107.592 3（C54H91O23，-3.4，［M-HC2H2O］-）、1 089.578 8（C54H89O22，-6.3，［M-H-AcOH］-）、945.534 9（C48H81O18，-8.2，［M-H-C2H2OGlc］-）、783.489 4（C42H71O13，-1.6，［M-H-C2H2O-2Glc］-），最典型的為丟失乙酰基產生的碎片m/z1 089.578 8，其余碎片為乙酰基或葡萄糖基交替丟失產生，與對照品人參皂苷Rb1 的碎片類似。在質譜分子網絡中，峰B22與對照品人參皂苷Rb1相連，說明二者結構有相似性，存在乙酰化的修飾關系。進一步檢索數據庫，將峰B22確定為6′′′′-乙酰人參皂苷Rb1。

2.2.4 C-20 位脫糖基皂苷類成分的鑒定三七在炮制時，高溫會造成皂苷C-20 位糖苷鍵斷裂，生成C-20位脫糖基皂苷類成分，這類成分在熟三七中較常見。在本研究中，生三七僅檢測到2個此類成分，而砂燙三七中則檢測到19 個此類成分，說明砂燙也會造成皂苷C-20 位糖苷鍵的斷裂，形成轉化皂苷。這些皂苷類成分通過對照品鑒定出2個，即人參皂苷Rh4、Rk3，其他需根據質譜裂解行為和分子網絡進行推斷。以峰B54 為例說明解析過程，負離子模式下，測得峰B54 的［M+Cl］-801.453 8 和［M+HCOO］-811.483 3，預測其分子式為C42H70O12，具有8 個不飽和度。碎片離子可檢測到m/z603.424 4（C36H59O7，-2.2，［M-H-Glc］-）和457.362 6（C30H49O3，-6.1，［M-H-2Glc］-），為連續脫去兩分子葡萄糖基所產生；進一步檢測到m/z221.065 2（C8H13O7，-1.5）、179.056 0（C6H11O6，-0.1，［Glc-H］-） 和161.044 9（C6H9O5，-0.8，［Glc-H-H2O］-）等碎片，證明存在-Glc（2→1）Glc 取代基。在分子網絡中，峰B54 與峰B28 相關，說明二者糖基碎片相同，經檢索數據庫，發現人參皂苷Rk1 與推測裂解途徑符合，該化合物在C-3位含-Glc（2→1）Glc取代，C-20脫去糖基形成雙鍵。最終將峰B54鑒定為人參皂苷Rk1。

此外，在推測結構時，發現三七皂苷類成分存在較多的同分異構體，如A41、A42和A43，B54和B55，這些化合物在質譜分析中產生相同的離子碎片，通過質譜解析其結構存在較大困難。B54和B55的結構差異在于雙鍵的位置不同。由對照品得知，人參皂苷Rk3 的保留時間小于人參皂苷Rh4，說明人參皂苷Rk3 型的化合物極性較大，推測在質譜碎片相同的情況下，B54 應為人參皂苷Rk3 型的化合物，B55應為人參皂苷Rh4型的化合物。

2.3 生三七和砂燙三七中三萜皂苷的定量分析

選取6種代表性的皂苷作為對照品，按照“1.4”通過高效液相色譜法測定了生三七和砂燙三七中三萜皂苷的含量（表2）。結果顯示，人參皂苷Rb1、Rg1 和三七皂苷R1 作為原生皂苷，在生三七中含量較高，在砂燙三七中含量降低，尤其是人參皂苷Rg1和三七皂苷R1的含量降低較明顯，說明炮制會促進三萜皂苷的降解；人參皂苷Rg3、Rh4 和Rk3 作為轉化皂苷，雖在生三七的LC-MS 總離子流圖中被檢測到（圖3和表1），但由于其含量較低，且高效液相色譜不如質譜靈敏，因此在生三七中未檢測到上述3 個成分；相反，上述3 個成分在砂燙三七中的含量較高，分別為1.03%、5.49%和4.85%，說明三七經砂燙等方法炮制后，原生皂苷會脫水或降解生成轉化皂苷。

表2 生三七（A）和砂燙三七（B）總皂苷中三萜皂苷的定量分析結果Table 2 The quantitative analysis results of triterpenoid saponins in the total saponins of Panax notoginseng（A） and processed Panax notoginseng with hot sand（B）

2.4 討 論

炮制是使用中藥的常用方法，通過炮制可促進中藥化學成分發生變化，降低毒副作用或產生不同的生物學作用。三七作為云南省道地藥材，其生熟異用具有廣泛的研究基礎，而三萜皂苷的變化被認為是生熟三七產生不同功能的物質基礎［4-6］。常見的三七炮制方法為高溫蒸制，高溫蒸制后三七中的三萜皂苷發生脫水反應，脫去糖基，在C-20位形成雙鍵。本研究基于課題組前期工作基礎，采取操作簡便、溫度可控、耗時較短的砂燙方法炮制三七，獲得的砂燙三七可直接保存，便于后期制劑。LC-MS/MS分析發現，砂燙三七與生三七相比，能檢測到較多的三萜皂苷類成分，這些成分多為糖基降解形成的轉化皂苷，這與其他方法炮制獲得的熟三七化學成分相符。本研究還發現，生三七中含有大量的丙二酰基取代的皂苷類成分，經砂燙后這些成分在砂燙三七中均未檢測到，反而檢測到乙酰基取代的皂苷，說明三七經砂燙后，可促進丙二酰基取代的皂苷轉化為乙酰基取代的皂苷。但其他方法炮制的熟三七是否含有乙酰基取代的皂苷，以及乙酰基三萜皂苷是否是生熟三七藥效差異的原因，尚需實驗進行證明。后期將進一步研究驗證其他炮制方法的熟三七中乙酰基取代皂苷的生成情況，并對砂燙三七中更多的轉化皂苷進行含量測定，優化砂燙炮制三七的工藝技術；基于砂燙三七化學成分的變化，研究其生物學作用，最終闡明砂燙三七和生三七藥效差異的本質。

3 結 論

本文利用LC-MS/MS 結合分子網絡技術對生三七和砂燙三七的三萜皂苷類成分進行快速鑒定。分析了16種三萜皂苷類成分標準品的MS/MS裂解規律，發現在負離子模式下三萜皂苷類成分易丟失葡萄糖基、鼠李糖基或阿拉伯糖基等碎片，上述碎片的快速檢測和識別為鑒定三萜皂苷類成分奠定了基礎。通過結合對照品、保留時間、MS/MS裂解規律和分子網絡信息等從生三七中鑒定出50個三萜皂苷，砂燙三七中鑒定出60 個三萜皂苷，二者共有23 個皂苷類成分；生三七單獨含有27 個成分，包括11 個丙二酰基取代的皂苷；砂燙三七單獨含有37 個皂苷，包括19 個乙酰基取代的成分；有11 個皂苷類成分通過對照品進行驗證。定量分析發現，生三七中原生皂苷的含量較高，砂燙三七中轉化皂苷的含量較高。該研究豐富了生三七和砂燙三七的化學成分研究內容，為進一步揭示生三七和砂燙三七的生物活性差異奠定了基礎。