分散液液微萃取結合氣相色譜-四極桿-飛行時間質譜法測定橄欖油中180種農藥殘留

梁 艷，雷春妮，王 波，張 歡，王新潮，周小平，*，朱夢晨

（1.甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州海關技術中心，甘肅 蘭州 730010；3.西北師范大學 地理與環境科學學院，甘肅 蘭州 730070）

橄欖油由新鮮油橄欖果實冷榨而成，富有油酸及亞油酸等多種有益于人體的天然營養成分，被譽為“液體黃金”和“植物油皇后”。近年來橄欖油逐漸進入我國消費市場并呈現高速發展趨勢，國際橄欖理事會預言我國將成為未來世界第一大橄欖油消費國［1］。由于橄欖在種植和生長過程中施用農藥來達到預防蟲害的目的，且部分農藥不易降解，致使橄欖油中可能存在農藥殘留，其潛在風險不容忽視［2］。開展農藥殘留風險監測是保障橄欖油質量安全的重要措施，因此建立一種快速、高效、高通量篩查橄欖油中多種農藥殘留的檢測方法十分必要。目前關于橄欖油中農藥殘留檢測方法已有報道，如劉綱勇等［3］測定橄欖油中22 種有機氯農藥殘留，Iosif 等［4］測定橄欖油中39 種農藥殘留。但相關研究主要集中于1種或1類多農藥殘留的檢測，針對數百種不同極性、不同化學性質的多種農藥殘留的檢測報道較少。

關于橄欖油或含油量較高的植物油樣品中農藥殘留的前處理方法主要有固相萃取法（SPE）［5］、凝膠滲透色譜法（GPC）［6］、QuEChERS 法［7］等。分散液液微萃取法（DLLME）是2006年［8］被首次提出的一種集采樣、萃取和濃縮于一體的樣品前處理技術，通過形成水相、分散劑、萃取劑三元渾濁體系，增大目標物與萃取劑的接觸面積，經離心后將目標物轉移到萃取劑中，從而實現樣品成分的富集［9］。該方法具有富集倍數較高，操作簡單、快速，耗材成本低廉，對環境綠色環保等優勢，已被廣泛應用于多種無機和有機化合物的提取分析。目前DLLME 技術主要應用于水樣等基質簡單的液體樣品以及1 種或1類農藥殘留的檢測，如韓文濤等［10］利用現場DLLME 法檢測水體中5種擬除蟲菊酯類農藥，李芳芳等［11］利用DLLME 法測定植物油中11 種有機磷農藥殘留。然而運用DLLME 法檢測橄欖油復雜基質中數百種農藥殘留的分析鮮見報道。

在檢測技術方面，農藥殘留分析的常用技術有氣相色譜法（GC）［12］、氣相色譜-質譜法（GC-MS）［13］、氣相色譜-串聯質譜法（GC-MS/MS）［14］、液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）［15］等。氣相色譜-四極桿-飛行時間質譜法（GC-QTOF MS）既具有高分離能力，又具有高質量分辨率、高掃描速率等優勢，并且其實驗數據可進行重復分析，極大提高了工作效率，在非靶向未知物篩查及高通量篩查方面的研究較為成熟，適合橄欖油中農藥殘留的高通量檢測。

本研究基于綠色環保理念，將DLLME與GC-QTOF MS法相結合，建立了一種準確、快速、便捷且綠色環保的橄欖油中180 種農藥殘留的檢測技術，以期為橄欖油中農藥殘留的快速監測分析提供技術支持，為復雜基質的前處理提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

GC-QTOF MS 7890B-7200氣相色譜-四極桿-飛行時間質譜儀（美國Agilent公司）；BC-1000多管旋渦混合儀（深圳逗點生物技術有限公司）；3K30 臺式高速冷凍離心機（美國Sigma 公司）；20～200 μL、100～1 000 μL、1.0～5.0 mL、5.0～10.0 mL 移液槍（德國Eppendorf 公司）；BSA822 電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）。

100 μg/mL 180種農藥標準品（以乙酸乙酯為溶劑，天津阿爾塔科技有限公司）；實驗用水（蒸餾水，屈臣氏）；乙腈（分析純，天津市富宇精細化工有限公司）；甲酸（分析純，天津市百世化工有限公司）；乙醚（分析純，利安隆博華（天津）醫藥化學有限公司）；三氯甲烷、甲苯、環己烷（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；四氯化碳（分析純，天津市登豐化學品有限公司）。

橄欖油樣品為市售的特級初榨橄欖油。

1.2 樣品前處理

稱取1.0 g 橄欖油試樣于15 mL 離心管，加入2 mL 含2%甲酸的乙腈溶液提取，渦旋3 min，并在-5 ℃下以5 000 r/min 冷凍離心3 min。取1 mL 上清液于15 mL 離心管中，加入200 μL 三氯甲烷，再加入9 mL 水，渦旋3 min，并在-5 ℃下以5 000 r/min 冷凍離心3 min。取離心管底部液滴至含有襯管的進樣瓶中，待測定。

1.3 標準溶液的配制

將質量濃度為100 μg/mL的農藥標準品用乙酸乙酯配制成質量濃度為5 μg/mL的農藥混合標準中間溶液。該溶液用經“1.2”處理的空白橄欖油基質提取液逐級稀釋，配制成系列質量濃度的基質混合標準溶液。

1.4 儀器分析

1.4.1 色譜條件色譜柱：HP-5MS UI 柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；進樣口溫度：280 ℃；進樣模式：不分流進樣；載氣：氦氣，純度≥99.999%；載氣流速：1 mL/min；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持2 min，以40 ℃/min 升溫至120 ℃，以3 ℃/min 升溫至255 ℃，再以10 ℃/min 升溫至300 ℃，保持6 min；進樣量：1 μL。

1.4.2 質譜條件離子化模式：電子轟擊（EI）源；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；監測模式：全掃描模式；掃描范圍：m/z35～500；掃描速率：5 spectra/s；四極桿溫度：150 ℃；碰撞氣：高純氮氣（99.999%）。

1.5 數據處理

數據采集通過Agilent Mass Hunter Acquisition 7200 軟件完成，數據處理通過Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis B.07.00軟件完成，數據分析通過Agilent Mass Hunter TOF 定量分析軟件分析。每種農藥選擇響應較好且無明顯干擾的離子用于定量及定性分析，并參照GB 23200.8-2016《食品安全國家標準 水果和蔬菜中500種農藥及相關化學品殘留量的測定 氣相色譜-質譜法》［16］選擇1個定量離子及2個定性離子（見表1）。

表1 橄欖油中180種農藥的保留時間、定量離子、定性離子、線性范圍、檢出限、定量下限、加標回收率與相對標準偏差（n=6）Table 1 Retention times，quantitative ions，qualitative ions，linear ranges，LODs，LOQs，spiked recoveries and RSDs of the 180 pesticides in olive oils（n=6）

（續表1）

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 乙腈酸化濃度的優化橄欖油的主要成分為油脂，會給后續分析帶來強烈干擾。乙腈中可溶入的油脂量極少，且對絕大多數農藥的溶解度較大，因此本實驗中乙腈既是提取溶劑，又是 DLLME分散劑。由于部分農藥可能對酸堿度較為敏感，考察了含0、0.5%、1%、2%、5%、10%（體積分數）甲酸的乙腈溶液對180 種農藥的提取效果。如圖1 所示，回收率在70%～120%范圍的農藥數量隨甲酸體積分數的增大先增多后減少，說明乙腈酸化程度對農藥回收率有著較大影響。采用含2%甲酸的乙腈溶液提取時，回收率在70%～120%范圍的農藥數量最多，占全部被測農藥的76.67%，因此選擇使用含2%甲酸的乙腈溶液進行提取。

圖1 不同乙腈酸化濃度提取時180種農藥的回收率（Rec.）分布（n=3）Fig.1 Recovery（Rec.） distributions of the 180 pesticides extracted by different acetonitrile acidification concentrations（n=3）

2.1.2 水相體積的優化DLLME 體系中分散劑、萃取劑和水相的體積將影響農藥的萃取效率，增加水相體積會影響方法靈敏度以及基質效應，導致樣品經前處理后離心管底部液滴的體積有一定變化，從而影響后續檢測［17］。考察了不同水相體積（6、7、8、9、10 mL）對180 種農藥的提取效果，結果見圖2。隨著水相體積的增加，回收率在70%～120%范圍的農藥數量呈明顯變化，說明在快速富集過程中農藥的提取效率與水相體積有關；當加水量為6、7、8 mL 時提取效率較低，可能與提取不充分有關，而加入9 mL 水時農藥的回收率最高，有利于后續測定。因此最終選擇水相體積為9 mL。

圖2 不同水相體積時180種農藥的回收率分布（n=3）Fig.2 Recovery distributions of the 180 pesticides in different water phase volumes（n=3）

2.1.3 萃取劑種類的優化在DLLME 中，合適的萃取劑能夠提高目標化合物的萃取效率。萃取劑需滿足以下要求：不易溶于水；易溶于分散劑；目標化合物易溶于萃取劑；萃取劑的密度大于油類基質與分散劑的混合溶液［18］。考察了萃取劑分別為三氯甲烷、四氯化碳、甲苯、乙醚、環己烷時的提取效果。結果表明：加入甲苯時，油類基質與分散劑的混合溶液密度大于萃取劑，沉淀物在上層；加入乙醚時，分散劑、萃取劑和水三相互溶；加入環己烷時，形成白色乳濁液；加入四氯化碳時，180 種農藥中有73.33%的農藥回收率在70%～120%范圍內；而加入三氯甲烷時，該占比提高至76.67%（見圖3）。因此選擇三氯甲烷作為萃取劑。

圖3 不同萃取劑種類時180種農藥的回收率分布（n=3）Fig.3 Recovery distributions of the 180 pesticides in different extraction types（n=3）

2.2 基質效應

基質效應（ME）是指樣品基質中除分析物以外的其他成分所引起的檢測信號增強或減弱現象［19］。一般通過比較目標物在空白基質提取液和純溶劑中的響應進行評估：ME=農藥在基質標準溶液的響應/農藥在溶劑標準溶液的響應。當ME 低于0.8 時為基質抑制效應；ME 在0.8～1.2 之間時為弱基質效應；ME大于1.2時為基質增強效應。對180種農藥的基質效應進行了考察，結果表明，2%的農藥表現為基質抑制效應，58%的農藥表現為弱基質效應，40%的農藥表現為基質增強效應。因此采用空白基質配制標準溶液進行定量。180種農藥的基質標準溶液提取離子色譜圖見圖4。

圖4 180種農藥的基質標準溶液提取離子色譜圖Fig.4 Extract ion chromatogram of the 180 pestcides in matrix standard solution

2.3 方法學考察

2.3.1 線性范圍、檢出限與定量下限采用本方法對“1.3”配制的基質混合標準溶液進行分析，以目標化合物的質量濃度為橫坐標（x，μg/mL），峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線。由表1 可知，87.8%農藥的線性范圍為0.02～2 μg/mL，12.2%農藥的線性范圍為0.1～2 μg/mL，相關系數（r2）均大于0.99，表明180種農藥在各自線性范圍內關系良好，滿足檢測要求。以3倍信噪比（S/N=3）為檢出限、10倍信噪比（S/N=10）為定量下限，得到180 種農藥的檢出限為0.002～0.020 mg/kg，定量下限為0.007～0.067 mg/kg。其中有135 種農藥的定量下限達到0.007 mg/kg，23 種農藥的定量下限達到0.017 mg/kg，占總數量的88%；5%農藥的定量下限為0.033 mg/kg；7%農藥的定量下限為0.067 mg/kg。

2.3.2 準確度及精密度在空白橄欖油試樣中，分別進行0.02、0.1、0.2 mg/kg 3個水平的加標回收實驗，每個水平做6 個平行，考察180 種農藥的準確度與精密度。結果表明：在上述3 個加標水平下，回收率為70%～120%的農藥占全部被測農藥的76.3%，相對標準偏差（RSD）小于10%的農藥占總數的94.4%以上（見表1）。該方法的準確度與精密度良好，可滿足多農藥殘留分析的要求。

2.4 實際樣品檢測

實驗對10份市售橄欖油試樣進行檢測，共檢出5種農藥，檢出量為0.005 7～0.042 7 mg/kg。其中4份橄欖油試樣中均檢出敵敵畏，含量為0.011 1～0.012 4 mg/kg；1份橄欖油試樣中檢出敵敵畏、克百威和三唑醇3 種農藥（見表2）。與我國現行GB 2763-2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》［20］相比，敵敵畏、克百威、三唑醇、殺蟲畏的殘留量未超過其最大殘留限量值，禾草丹暫未規定最大殘留限量值。

表2 市售橄欖油中農藥殘留的檢出情況Table 2 Detection of pesticide residues in olive oils on the market

3 結 論

本研究基于綠色環保理念，將分散液液微萃取與氣相色譜-四極桿-飛行時間質譜法相結合建立了一種快速測定橄欖油中多農藥殘留的分析方法，并考察了乙腈酸化濃度、水相體積、萃取劑種類對180 種農藥殘留測定的影響。該方法操作簡單、快速，靈敏度高，成本低，綠色環保，準確度及精密度良好，滿足橄欖油中農藥殘留高通量檢測的要求，為市場監管部門對食用油中農藥殘留的快速監測提供了技術支持，為復雜基質的前處理提供了參考。