電裂解芯片及其在細菌核酸分析中的應用

程 潔，蔡霜霜，王其友，陳纘光*，童艷麗

（1.中山大學 藥學院，廣東 廣州 510006；2.南方醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院，廣東 廣州 510500；3.廣東省第二人民醫(yī)院，廣東 廣州 510310）

核酸提取是病原體研究的基本步驟，而細菌裂解是第一步。細菌裂解可分為機械［1］、物理［2］、化學［3］或生物方法［4］。機械方法是使細胞膜通過機械剪切力被物理分解，常見的機械設(shè)備包括高壓均質(zhì)器和珠磨機［5-6］。物理方法［7］是一種利用外力破壞細胞膜的非接觸方法，這些力包括熱能［8］、高壓［9］、電能［10］和聲能［11］。化學方法是通過改變裂解緩沖液pH 來破壞細胞膜或在裂解緩沖液中加入表面活性劑，使膜蛋白溶解，并使膜破裂釋放其內(nèi)容物［12］。生物方法是通過酶解作用破壞細菌/細胞結(jié)構(gòu)，常用的酶解酶包括溶菌酶、纖維素酶等［13］。

然而傳統(tǒng)的裂解方法存在裝置復雜、化學試劑污染、成本高、樣品用量大等局限性。微流控芯片因其小型化、低消耗、集成化等優(yōu)點而被廣泛應用于微生物分析。目前的裂解方法有：機械裂解［14］、熱裂解［15］、化學裂解［16］、光學裂解［17］、聲學裂解［18］和電裂解［19］。這些方法中，電裂解是通過在細胞膜上施加一個強電場，從而產(chǎn)生跨膜電位，當電位高于閾值電位時，細胞膜上會形成孔，細胞外物質(zhì)可滲透過細胞膜，然后通過滲透沖擊破壞細菌結(jié)構(gòu)。電裂解是一種快速、無試劑的裂解方法，廣泛應用于微流體領(lǐng)域。目前，常見的電裂解方法是利用高頻低壓交流電（AC）或高壓直流電（DC）對細菌施加強電場，產(chǎn)生跨膜電位。微流控芯片也成功地用于細胞/細菌裂解。Ameri 等［20］使用直流源裂解微流控芯片中的紅細胞，通過裂解前后阻抗值的下降證明細胞裂解，該裝置的裂解效率為87%。Escobedo等［21］設(shè)計了一種借助手持Corona裝置對微流控芯片中的細胞進行裂解的電裂解方式，通過顯微鏡觀察和細胞活力熒光探針測定，比較細胞裂解前后的形態(tài)和活力變化共同證明該裝置的裂解性能。結(jié)果表明該裝置可以完全裂解多種細胞，且研究表明未產(chǎn)生焦耳熱效應。Wei等［22］使用氧化銦錫（ITO）玻璃電極和聚二甲基硅氧烷（PDMS）設(shè)計了微流控電解芯片。該裝置可在16 V、10 kHz 低壓交流電下成功裂解多個細胞。然而，上述方法雖能高效裂解細菌或細胞，但尚未用于細菌核酸的提取。

本文研究了一種利用帶有ITO 玻璃電極的微流控芯片同時進行電裂解細菌和提取核酸的方法，研究了電場強度（E）、電極距離（d）、裂解時間和ITO 電極參數(shù)對核酸提取的影響，并實現(xiàn)了無污染、無試劑引入、低成本、操作簡單、快速方便地對多種細菌的電裂解和核酸提取。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

聚二甲基硅氧烷（PDMS，Sylgard184）購自美國道康寧公司；卡那霉素、甘油、PBS 緩沖液（pH 7.4）購自生工生物工程（上海）有限公司；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞、大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞、異丙基-b-D-硫代半乳糖苷溶液（IPTG）、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；實時熒光定量PCR 擴增試劑盒BeyoFast SYBR Green qPCR Mix（2X）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB 肉湯培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Pet28a-EGFP 質(zhì)粒購自淼靈質(zhì)粒平臺；過氧化氫溶液、鹽酸購自國藥集團化學試劑有限公司；實驗所用其它試劑均為分析純，實驗用水均為超純水。實驗所用的DNA序列設(shè)計后委托生工生物工程（上海）有限公司合成并純化。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-100 恒溫震蕩搖床（上海葉拓科技有限公司）；LRH-150 生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）；PDC-32G-2氧等離子體發(fā)生器（美國Harrick Plasma公司）；LDZM-40L高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；lightCycler480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR 儀（瑞士羅氏醫(yī)學儀器公司）；H1850R 臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；Nikon ECLIPSE Ti-S 熒光倒置顯微鏡（日本尼康株式會社）；Olympus FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯）。

1.3 細菌培養(yǎng)

通過熱激法將帶有卡那霉素抗性的Pet28a-EGFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，37 ℃培養(yǎng)16 h 后，挑取單菌落，置于含有50 μg/mL 卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃震蕩培養(yǎng)16 h，挑選單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，再通過熱激法轉(zhuǎn)染至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)16 h后置于30%甘油中保種，后續(xù)復蘇取20 μL菌種置于5 mL LB 培養(yǎng)基振搖10 h后加入25 μL 50 mg/mL的異丙基-b-D-硫代半乳糖苷溶液（IPTG）繼續(xù)振搖10 h，得到實驗用大腸桿菌。轉(zhuǎn)染了增強型綠色熒光蛋白（EGFP）質(zhì)粒的大腸桿菌在488 nm 激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，使用激光掃描共聚焦顯微鏡可以直觀、方便地觀察裂解情況。除去培養(yǎng)基上清（8 000 r/min，離心3 min），將細胞重懸于1 mL PBS 中，以獲得約109CFU/mL 的菌液濃度。使用平板計數(shù)法測定細菌濃度，用PBS連續(xù)稀釋細胞，然后將0.2 mL稀釋液涂在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，并手動細菌菌落計數(shù)。基于光密度測量的比濁法（OD600）也用于細菌計數(shù)。

本研究使用的其余6 種細菌均購自廣東省微生物菌種保藏中心，包括金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。所有細菌均在37 ℃的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h后使用。

1.4 細菌核酸提取（細菌電裂解）

核酸提取在室溫（25 ℃）下進行。細菌裂解芯片的裂解池依次用親水改性溶液（1.0%鹽酸和1.0%過氧化氫混合溶液）［23］、水洗滌，然后用潔凈的氮氣吹干后使用。以大腸桿菌為例，將20 μL細菌懸浮液（除另有說明，菌液濃度為1×109CFU/mL）置于裂解池中，然后通過直流電源發(fā)生器（實驗室自制［24］）產(chǎn)生E為0.6～10 kV/mm的平行電場。裂解3 s后，無需進一步純化DNA即可進行PCR分析。

1.5 細菌裂解微流控芯片的設(shè)計與制作

細菌暴露在強電場中時，細胞膜內(nèi)外會形成跨膜電位（Δφg）。Δφg在0.2～1 V 時，細胞膜上會產(chǎn)生可逆的孔。Δφg大于1 V 時，會引起細胞膜通透性發(fā)生不可逆的變化，在強電場下，細菌的細胞膜發(fā)生電穿孔，細菌的細胞質(zhì)和細胞外介質(zhì)之間會發(fā)生滲透壓失衡，最終導致細菌破裂［25］。在直流電場中，Δφg由下式給出［26］：

其中F由細菌細胞形狀決定［26］：

式中l(wèi)是細胞長度，a是半徑。對于球形細胞F=1.5，l=2a；桿狀細胞F=1，l＞＞2a。E為電場強度，近似為E=U/d，其中U表示施加的電壓，d為電極間距。細胞偶極矩與電場方向間的角度α可以是0°或180°，因此cosα=1（α=0°）或 -1（α=180°）。

基于上述概念，本實驗設(shè)計了微流控細菌核酸提取芯片（示意圖如圖1 所示），通過高壓直流電裂解細菌來提取DNA。該核酸提取芯片由雙層微流控芯片組合而成。上層裂解池由PDMS 制成，銅模上有一組直徑為4.5 mm、高3 mm 的圓柱，用于PDMS 注模成型。PDMS 以單體（C2H6OSi）與固化劑10∶1（w/w）的比例混合，并在40 Torr（1 Torr 即1mmHg）壓力下脫氣以除去殘留的氣泡，然后將PDMS 倒入銅模中，厚度為3 mm，在65 ℃下熱固化2 h，冷卻至室溫（25 ℃）后從銅模中取出，得到帶孔（直徑4.5 mm，高度3 mm）的裂解層。底層由光學透明的ITO 鍍膜玻璃制成，ITO 層的厚度約為1 200 nm，方阻（正方形導電薄膜邊到邊之間的電阻）值為1 ～ 2 Ω/cm2。通過激光蝕刻，在涂有ITO 的鍍膜玻璃上形成10組平行電極對，電極寬度為0.8 mm，電極間距為0.5 mm。使用氧等離子體發(fā)生器處理上層（PDMS）和底層（ITO 鍍膜玻璃），并在80 ℃下粘合3 h 形成不可逆鍵合的微流控芯片。PDMS 層中的孔和ITO 涂層玻璃中的電極構(gòu)成電裂解單元。

圖1 細菌核酸提取芯片的原理圖Fig.1 Schematic diagram of a bacterial nucleic acid extraction chip

將細菌放入裂解池中，將直流電源連接到一組平行電極對，在兩個電極之間產(chǎn)生強電場。維持該狀態(tài)幾秒。細菌細胞膜被電場擊穿，進而造成細胞質(zhì)與細胞膜外介質(zhì)之間的滲透壓失衡，最終導致細菌破裂。細胞裂解液（包括DNA和蛋白質(zhì)）被收集在裂解池中。裂解完成后，無需進一步純化DNA，即可利用實時熒光聚合酶鏈反應（RT-PCR）計算核酸的提取效率。

1.6 實時熒光定量PCR

采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）定量分析細胞裂解效率和核酸提取效率。使用引物組［27］（正向：5'- AGAAGCTTGCTCTTTGCTGA-3' 和反向：5'-CTTTGGTCTTGCGACGTTAT-3'）擴增目標120 bp DNA片段，該片段為16S rRNA 的核心區(qū)域基因（Genbank：NO. J01859.1）。實時熒光定量PCR 擴增反應總體積為20 μL，包括10 μL BeyoFast SYBR Green qPCR Mix（2X），1 μL 10 mmol/L 上游引物、1 μL 10 mmol/L 下游引物、6 μL 無菌水、2 μL 合成質(zhì)粒作為DNA 模板。對于陰性對照，使用2 μL 無菌水代替DNA 模板。將該擴增體系在95 ℃下熱變性2 min，然后分別在95 ℃保持30 s、54 ℃保持30 s、72 ℃保持30 s 中進行40 個循環(huán)。根據(jù)實時熒光定量PCR 儀測定的循環(huán)周期數(shù)（CT）值計算待測模板DNA 的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 細菌電裂解效果的顯微觀察

為驗證電裂解芯片對細菌的裂解能力，固定d為0.5 mm，裂解時間為3 s，在不同E值下裂解大腸桿菌，將裂解后的細菌稀釋1 000 倍，接種于營養(yǎng)瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)24 h 后，觀察菌落生長情況，結(jié)果如圖2所示。當E小于1.5 kV/mm時，與對照組相比，僅有少量細菌被裂解，平板上的菌落數(shù)目雖明顯減少，但仍有大量菌落生長；當E值大于1.5 kV/mm 時，平板培養(yǎng)的結(jié)果顯示：幾乎所有的大腸桿菌被裂解，僅有極少數(shù)菌落生長。圖2結(jié)果表明，電裂解芯片可實現(xiàn)對細菌的高效裂解。

圖2 不同裂解條件下大腸桿菌的菌落培養(yǎng)結(jié)果Fig.2 Results of E.coli colony culture under different lysis conditions

為更直觀地觀察電裂解芯片對細菌裂解效果，將裂解后的菌液置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。由于所使用的大腸桿菌內(nèi)含有EGFP 熒光蛋白質(zhì)粒，其可在488 nm 的藍光激發(fā)下，發(fā)出綠色熒光，可在顯微鏡下更直觀地觀察到細菌裂解前后的變化。圖3結(jié)果表明，當E值為2.0 kV/mm時，裂解芯片可以裂解約90%的細菌，細菌細胞膜的破裂使其表達的綠色熒光蛋白流出細胞，無法看到完整細菌形態(tài)，顯微鏡下熒光消失。菌落的培養(yǎng)結(jié)果也可以直觀地觀察到菌落數(shù)目的大量減少。菌落培養(yǎng)和激光共聚焦顯微鏡下的實驗現(xiàn)象均證明了裂解芯片裂解細菌的能力。

圖3 E為2.0 kV/mm時裂解大腸桿菌的菌落培養(yǎng)裂解效果Fig.3 Colony culture lysis effect of lysed E. coli at E of 2.0 kV/mm

根據(jù)公式（1），在直流電場中，對于同一種細菌，跨膜電位的大小與電場強度E之間存在直接關(guān)系。隨著E的增加，跨膜電位隨之增加，導致電穿孔發(fā)生，細胞破裂，釋放出可被檢測的核酸。電裂解性能可通過計算核酸釋放量進行表征。因此，本文研究了E對大腸桿菌電裂解性能及其核酸提取效率的影響。裂解效率的計算采用RT-PCR同時測定電裂解樣品中的核酸濃度（C）和未經(jīng)裂解（對照組）樣品的核酸濃度（C0），以C與C0的比值（C/C0）作為判斷電裂解效率的依據(jù)。結(jié)合圖2與圖4A可知，隨著E值的增大，大腸桿菌的裂解效果顯著提高，且當E為1.5 kV/mm時，核酸的提取效率最高。

圖4 電裂解核酸提取芯片的裂解條件優(yōu)化Fig.4 Optimization of lysis conditions for electrolysis of nucleic acid extraction chips

根據(jù)公式E=U/d，當電場強度（E）固定時，電壓U與電極間距（d）成正比。固定E為1.5 kV/mm，考察了不同d對核酸提取效率的影響（圖4B）所示。結(jié)果顯示d在0.2 ～ 3.5 mm 范圍內(nèi)均能高效地裂解細菌，當d為0.5 mm 時核酸提取效率最高。這可能是由于d較小時，處于電場內(nèi)的細菌較少；但當d較大時會導致電場強度較低。

本實驗進一步考察了ITO玻璃電極的方阻、ITO電極的寬度及裂解時間對核酸提取效率的影響。如圖4C 所示，方阻值為1 ～ 2 Ω/cm2的ITO 玻璃電極的核酸提取效率高于其他平方電阻值（方阻值為6 ～ 7 Ω/cm2）的提取效率。圖4D 表明，當電極寬度為0.5 mm 時，核酸的提取效率較低，當電極寬度增加到0.8 mm 和1.0 mm 時，核酸提取效率明顯提高，且二者的裂解效率無顯著差異。如圖4E 所示，當裂解時間為3 s時得到的核酸量最高；縮短和延長裂解時間均會導致核酸裂解量的明顯減少，實驗結(jié)果與電場強度的優(yōu)化結(jié)果類似（圖4A）。這可能是由于長時間處于高電場中導致釋放的DNA 片段降解和破壞［28］。

2.2 芯片用于提取多種類型細菌的核酸

將優(yōu)化后制備的芯片，應用于革蘭氏陽性菌：表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌，以及革蘭氏陰性菌：鼠傷寒桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌等不同類型細菌的核酸提取，樣品體積為20 μL，裂解時間為3 s。實驗結(jié)果表明，該電裂解芯片能有效裂解多種細菌，并提取出包括革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、球菌和桿菌在內(nèi)的核酸。考察各類細菌在不同電場強度（E）下的核酸提取效率，通過RT-PCR 計算核酸提取量。實驗發(fā)現(xiàn)，與大腸桿菌不同，金黃色葡萄球菌和枯草桿菌等細菌在PCR 熱循環(huán)中未被裂解，導致核酸無法被提取，因此未被電裂解的對照組的PCR 擴增實驗結(jié)果為陰性。造成這種差異的原因可能是兩種不同類型細菌的細胞壁厚度不同，革蘭氏陰性細菌的細胞壁厚度為10 ～ 15 nm，僅含有1 ～ 3 層肽聚糖，而革蘭氏陽性細菌的細胞壁厚度為15 ～ 80 nm，細胞壁含有多達50 層肽聚糖。由于肽聚糖層致密，革蘭氏陽性細菌更難溶解［29］。如圖5 所示，基于每種細菌的獨特性質(zhì)和細胞形態(tài)，不同的細菌達到最高裂解效率所需的最佳E值也略有不同，當E值為3.0 kV/mm 時，該芯片可以高效地提取上述7 種細菌的核酸。結(jié)果表明，本文的核酸提取芯片可用于多種細菌的裂解和核酸提取，提取的細菌核酸濃度從6.8 amol/L（金黃色葡萄球菌）到320 fmol/L（鼠傷寒沙門氏菌）不等，且各種細菌的核酸提取液可直接用于PCR 擴增，無需任何優(yōu)化。這也證明了該芯片對細菌核酸提取的通用性。

2.3 不同裂解方式的裂解效果比較

采用4 種不同方法對大腸桿菌進行裂解：在冰浴中超聲45 min、傳統(tǒng)的熱裂解方法（20 個熱循環(huán)，一個循環(huán)包括95 ℃，30 s和30 ℃，30 s）、細菌裂解液（上海貝博生物科技有限公司）和電裂解。圖6顯示了激光共聚焦顯微鏡觀察到的不同方法對大腸桿菌的裂解效果。結(jié)果顯示，超聲波幾乎能裂解所有細菌，而其余3種方法能裂解80%以上的細菌。4種方法的裂解性能相當，無顯著差異，但本文研制的電裂解芯片能在更短的時間內(nèi)（少于10 s）用更小的樣品體積（約20 μL）裂解細菌并提取核酸。后續(xù)的RT-PCR 結(jié)果也表明，電裂解的細菌裂解液可直接用于核酸擴增實驗，而無需單獨的核酸純化步驟。研究結(jié)果也表明，雖然該微流控芯片能實現(xiàn)對10份細菌樣品（芯片設(shè)計10個平行裂解池）中核酸的同時快速提取，但尚未能進行更高通量的核酸提取。若想實現(xiàn)一次實驗中同時提取更多樣品的核酸，還需對芯片設(shè)計進行后續(xù)優(yōu)化。

圖6 不同細菌裂解方法下的大腸桿菌Fig.6 E. coli under different bacterial lysis methods

2.4 與已有電裂解方法的對比

將本方法與其他電裂解方法進行比較（見表1）。從表中可以看出，研究者們選用直流或交流電實現(xiàn)平行電場下細菌或細胞裂解，所用電壓雖有明顯差異，但多數(shù)電裂解方法可實現(xiàn)1 min內(nèi)的細胞膜電穿孔，表明電裂解是一種高效且應用廣泛的技術(shù)。雖然已有文獻將電裂解技術(shù)應用于細菌和細胞的裂解，但目前仍少有將電裂解用于細菌核酸提取的研究，更未對細菌核酸提取效果進行設(shè)計和優(yōu)化。電裂解技術(shù)有節(jié)能、高效、操作簡單的特點，本研究將電裂解技術(shù)與微流控芯片結(jié)合，為微量細菌核酸提取與分析提供了新方法。且相較于之前的研究，本研究使用多種類型的細菌驗證了電裂解芯片的核酸提取能力，證明了該芯片的通用性。

表1 本研究與已有電裂解方法的對比Table 1 Comparison of this study with the existing electrolysis methods

2.5 實時熒光定量PCR的線性范圍

以原核生物共有的保守區(qū)基因16S rRNA 的120 bp 片段的質(zhì)粒作為模板DNA，將質(zhì)粒樣品逐級稀釋后用實時熒光定量PCR檢測（圖7A），確定該檢測方法對DNA的線性范圍為10-18～10-10mol/L，實時熒光擴增曲線與線性關(guān)系如圖7B 所示。該檢測方法線性關(guān)系良好，線性方程為Y=-3.295 8logCDNA-26.958，式中，Y 為CT值（實時熒光定量PCR 測定的循環(huán)周期數(shù)）；CDNA為待測模板DNA 的濃度，方法的線性系數(shù)（R）為0.999 6，檢出限為4.2×10-18mol/L。

圖7 16S rRNA基因的實時熒光定量PCR檢測（A）及線性范圍對應的熒光-時間曲線（B）Fig.7 RT-PCR assay of 16S rRNA gene（A） and fluorescence-time curve corresponding to the linear range（B）

3 結(jié) 論

本研究通過將ITO 電極與PDMS 基片結(jié)合構(gòu)建了一種可在直流電場中實現(xiàn)多種細菌裂解和核酸提取的微流控芯片。該芯片能在短時間內(nèi)裂解多種細菌（包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草桿菌、肺炎雙球菌、傷寒桿菌和銅綠假單胞菌），釋放可被檢測的核酸。研究結(jié)果表明，適當?shù)腅、d和裂解時間有利于核酸的提取，不同類型細菌提取核酸所需的最佳裂解條件略有不同，可根據(jù)特定細菌的特性進行調(diào)整。與傳統(tǒng)的核酸提取方法相比，本方法適用于小體積樣品的核酸提取，無化學污染，獲得的裂解液無需純化即可用于核酸擴增。與其他的細菌電裂解方法相比，本文通過定量PCR 實驗驗證了該裝置在細菌裂解和核酸提取方面的性能。此外，該芯片與定量PCR 聯(lián)用可以實現(xiàn)10-18～ 10-10mol/L 范圍內(nèi)細菌核酸的定量檢測，而更好地應用于細菌分析。該微流控芯片操作簡單、成本低廉、易于操作、提取速度快，能有效裂解多種細菌，適用于多種場景下的細菌檢測，為病原體分析和細菌感染的醫(yī)學診斷提供了一種簡單、快速、無化學試劑且高效的核酸提取方法。