牛冷凍精液精子形態活力變化研究與分析

段 凱，李紅嬋，汪聰勇，徐美芳*

（1.河南省鼎元種牛育種有限公司，河南鄭州 450046；2.河南省獸藥飼料監察所，河南鄭州 450008）

人工授精技術在畜牧業發展中有著至關重要的作用，特別是在牛的繁殖育種中更為重要，牛的精液能夠長期冷凍保存，并在牛的繁育生產中得到大規模的應用與推廣。自20 世紀60 年代開始，牛的普通冷凍精液在肉牛和奶牛的人工授精中得到了廣泛應用，而且世界各國很快也相繼采用液氮作為保存牛常規冷凍精液的冷源。借助于精液冷凍保存技術，能有效地延長精液的可利用時間并通過精液運輸實現異地輸精，從而大幅度提高種公牛的利用效率，減少種公牛養殖量。然而，在牛的繁殖生產的實踐中發現，牛常規冷凍精液解凍后在室溫中保存，輸精時間越晚，與配母牛的受胎效果越差，這與解凍后精液品質的變化有關。頂體完整率、精子畸形率及精子活力是評價精液品質的主要指標。頂體異常包括頂體形態異常和頂體脫落。頂體正常的牛精子主要特征是有明顯的頂脊，頂體部分呈均勻一致的紫紅色，核環部分呈規則的月牙形，頂體輕微膨脹。頂體部分脫落和完全脫落意為頂體脫離精子，露出被頂體覆蓋的細胞核。頂體異常會導致頂體酶受到破壞，嚴重影響受精效果。

本研究通過探討牛常規冷凍精液解凍后的頂體完整率、精子畸形率和精子活力的變化，揭示解凍后不同時間內精液品質的變化規律，為牛冷凍精液解凍后質量水平的評定和人工授精的最佳時間提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選取河南某種公牛站41118268 號種公牛生產的同一批次300 劑常規冷凍精液，進行精液品質測定。

1.2 試驗儀器、設備、藥品及試劑

恒溫電熱水浴鍋（上海力辰儀器科技有限公司)、相差顯微鏡（奧林巴斯北京銷售服務有限公司)、血球計數器、載玻片、蓋玻片、密度儀（米尼圖生物技術（北京) 有限公司)、5.0mL 試管、吉姆薩染液（西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司)、香柏油、3.0%氯化鈉溶液。

1.3 測定方法

對每劑冷凍精液進行解凍稀釋，在剛解凍0h和解凍1、3、6、9h，均制作1 壓片標本、1 抹片標本，觀察并記錄精子的活力、密度、畸形率、頂體完整率以及前進運動精子數。

1.3.1 牛冷凍精液的解凍

解凍時迅速用鑷子夾住細管，直接投入37℃溫水中晃動10s，取出后再用手搓動7～8s 并擦干，剪去封口端，把精液注入到準備好的干凈、干燥、無菌的5.0mL 試管中，用溫度計測定解凍后的溫度。

1.3.2 精子活力檢查

取解凍好的細管凍精剪去封口端推入小玻璃管中混勻，取10μL 滴在37℃恒溫板上的載玻片上，蓋上蓋玻片后于37℃恒溫臺的顯微鏡下放大400 倍觀測活力和密度。精子的活力即前進運動精子數占總精子數的百分率。

1.3.3 精子畸形率檢查

剛解凍后在載玻片上滴1 滴精液制成抹片，干燥后用固定液固定30min，然后用吉姆薩染液染色1.5h 后鏡檢計算畸形率。

1.3.4 精子頂體完整率檢查

用測過畸形率的抹片，上面滴1 滴香柏油，用油鏡頭進行觀察，計算出頂體完整率和異常率。

1.3.5 前進運動精子數檢查

精液解凍后用血色素管準確吸取10μL，注入盛有0.99mL 3.0%氯化鈉溶液的試管內，混勻，使之成為100 倍稀釋的稀釋精液，將備好的血球計數板用血蓋片將計數室蓋好，用移液器吸取8μ L 稀釋精液于血蓋片邊緣，使精液自行流入計數室，均勻充滿。靜置約5min 后在顯微鏡下計數。

1.4 數據分析

試驗數據采用Excel 2010 及SAS 9.4 進行整理、分析，試驗結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 解凍后不同時間內的頂體完整率、精子畸形率和精子活力

由表1 可知，與剛解凍時相比，解凍后1h精子頂體完整率下降，但差異不顯著（P＞0.05)，解凍后3h、6h、9h 的精子頂體完整率顯著低于剛解凍時和解凍后1h（P＜0.05)。精子畸形率在精液解凍后隨著時間延長而逐漸升高，剛解凍時與解凍后1h 差異不顯著（P＞0.05)，但顯著低于解凍后3h、6h（P＜0.05)，且解凍后3h 的精子畸形率也顯著低于解凍后6h 的畸形率（P＜0.05)。精子活力在精液解凍后隨著時間延長而逐漸降低，剛解凍時的精子活力最高，與解凍后1h、3h、6h、9h 差異顯著（P＜0.05)，解凍后1h精子活力顯著高于6h（P＜0.05)，解凍后9h 時精子活力低于任何一個階段的活力，且差異顯著（P＜0.05)。

表1 種公牛精液不同解凍時間品質分析

2.2 解凍后的前進運動精子數

解凍后300 次測定結果顯示每劑精液的前進運動精子數都在0.9×107～1.2×107個/劑，平均每劑細管凍精前進運動精子數為1.0×107個。

3 討論

3.1 各精液品質變化規律

精子畸形包括頭部畸形和尾部畸形，頭部畸形的主要是頭大，頭小，長形頭，梨形頭，頭部突起等，尾部畸形的有中段線粒體膨脹、盡心端彎折、線粒體脫落、有原生質滴等，還有尾部彎曲、斷尾、無尾等。還有的精子發育不健全，尾和頭連在一起，尾未能完全伸開。本研究精液中精子畸形率在剛解凍時平均值已達到31%，而用于輸精的精液要求畸形率不得高于20%。這可能與精液自身品質有關，也可能是在進行冷凍保存時，精子已受到損傷。

有效精子數即呈直線前進運動的精子數，計算方法為精子總數乘以精子活率。牛每劑量冷凍精液前進運動精子數是評價凍精產品質量的一項關鍵性指標，該項指標不僅與受胎率有關系，還關系到優秀種公牛冷凍精液的產量及種公牛遺傳資源的利用率。根據《牛冷凍精液》（GB4143—2022) 規定前向運動精子數大于等于600 萬個/劑。目前國內對降低單劑量前進運動精子數也進行了初步的研究。李連起等[11]研究表明，當每劑量前進運動精子數降低到500 萬時，不影響其人工授精后的情期受胎率，可以廣泛推廣應用。雖然李慧穎等[12]認為牛細管凍精前進運動精子數不應低于800 萬，但張壯志等[13]研究表明當每劑量前進運動精子數降低到600 萬時，不影響其人工授精后的情期受胎率。王彥平[14,15]研究結果表明當每劑量中前進運動精子數降低到200 萬時，不影響青年牛人工授精后的情期受胎率。本試驗測得的前進運動精子總數平均值為1.0×107個/劑，達到了國標的要求但是相比而言，我國種公牛平均年單產較發達國家種公牛冷凍精液生產水平差距甚遠，難以滿足遺傳改良的整體需要，種公牛的遺傳潛力尚未得到充分的發掘與利用。為了在今后的牛改良工作中更大限度地利用優良種畜的遺傳資源，促進畜群良種化，使優良種公牛的冷凍精液發揮更大的作用，在不影響受胎率的情況下，可以嘗試降低凍精每劑量的前進運動精子數，以提高優秀種公牛的凍精產量，并保證理想的配種受胎率。

4 結論

剛解凍時頂體完整率、精子畸形率與解凍后1h 差異大，剛解凍時的精子活力最高。人工授精時，剛解凍精液與解凍1 小時內精液的頂體完整率較好、精子畸形率較低，此時輸精效果為佳。