白背飛虱Tramtrack蛋白結構特點及在受精卵和5齡若蟲頭部的高表達

馮博 楊梅 伍儉兒 王方海

摘要? ［目的］了解重要的轉錄因子Tramtrack蛋白的結構特點，以及在卵和5齡若蟲身體各部位的表達情況。［方法］在已獲得的白背飛虱tramtrack基因的cDNA序列基礎上，對其編碼的Tramtrack蛋白結構特點進行生物信息學分析。［結果］該蛋白等電點為8.24，屬于堿性蛋白，無信號肽，屬于親水性蛋白，有多個磷酸化位點，其三維結構主要是α-螺旋，少部分是β-折疊。定量PCR檢測表明在白背飛虱受精卵中tramtrack基因的表達明顯高于未受精卵；此外tramtrack基因在五齡若蟲頭部表達顯著高于在胸部或腹部表達。［結論］這是第一次有關水稻害蟲稻飛虱的Tramtrack蛋白的研究報道，為今后探究該蛋白在水稻害蟲中的具體功能角色提供前期基礎。

關鍵詞? Tramtrack；結構分析；白背飛虱；基因表達

中圖分類號? Q966? 文獻標識碼? A? 文章編號? 0517-6611（2024）04-0133-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.04.029

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Structural Characteristics of Tramtrack Protein and Its High Expression in the Head of Zygotes and Fifth Instar Nymphs of Sogatella furcifera

FENG Bo， YANG Mei， WU Jian.er et al

（State Key Laboratory for Biocontrol and Resource Utilization/Institute of Entomology， Sun Yat.sen University， Guangzhou， Guangdong 510275）

Abstract? ［Objective］To understand the structural characteristics of Tramtrack protein， and its expression in eggs and the 5th instar nymph.［Method］The structure of Tramtrack protein of Sogatella furcifera encoded by the obtained cDNA sequence of tramtrack gene was analyzed. ［Ｒesult］The protein was a basic protein， no signal peptide， a hydrophilic protein with multiple phosphorylation sites and its isoelectric point was 8.24. The three.dimensional structure of the protein was mainly α.helix， and a small part was β.fold.? Quantitative PCR detected that the mRNA level of tramtrack gene in the fertilized eggs of white.backed planthopper was much higher compare to that in unfertilized eggs.? In addition， the mRNA level of tramtrack gene in the head of fifth instar nymphs was much higher compare to that in the chest or abdomen.? ［Conclusion］This is the first detailed report on the Tramtrack protein of white.backed planthopper， which lays a foundation for further in vitro expression and functional study of this protein gene， and is conducive to the future exploration of the specific function and regulatory role of this protein in the growth and development of rice planthopper.

Key words? Tramtrack；Structural analysis；Sogatella furcifera；Gene expression

基金項目? 廣東省自然科學基金項目（2021A1515012402）。

作者簡介? 馮博（1997—），男，天津人，碩士研究生，研究方向：昆蟲學。*通信作者，教授，博士，從事昆蟲學研究。

收稿日期? 2023-02-18

Tramtrack蛋白是由tramtrack基因編碼的蛋白質，隸屬于BTB（Broad-complex，Tramtrack，and Bric.a.brac）蛋白家族，最早發現于果蠅［1］。對tramtrack基因的研究表明，該基因具有特定的鋅指結構，在其N末端則帶有BTB結構域，也稱為poxvirus and zinc finger（POZ）結構域。組成該結構域的120個氨基酸以疏水性氨基酸為主，形成由4段α螺旋和部分β折疊所組成的二級結構，進一步形成具有特定的可與其他蛋白發生相互作用的三維空間結構［2-3］。該結構域既可以參與同源二聚體的形成和蛋白質間的交互作用，也能改變染色質的結構，導致特定基因的開關［4-5］。BTB 蛋白遍布在整個真核生物中，且不同物種間的BTB蛋白高度保守［2］。研究發現BTB 蛋白具有多種功能，如調節轉錄、重構染色質、降解蛋白等。在哺乳動物中也有報道BTB 蛋白影響淋巴細胞發育、軸突導向和性腺形態發生等［5］。而鋅指蛋白可與特定的DNA 序列結合，從而影響或調控某些基因的表達［6］。

tramtrack基因已發現多種，表達的蛋白功能多樣，在生物體生長發育等過程中起到重要的調節作用。研究發現在果蠅中該基因參與神經系統的分化［7-8］、調節卵泡成熟及排卵［9］、參與雄性求偶行為調節［10-11］等。隨著測序技術的進步和發展，許多昆蟲基因組序列得到解碼和公布，愈來愈多的昆蟲tramtrack基因被發現［12-13］，但除果蠅外，其他昆蟲中有關Tramtrack蛋白的結構和功能則研究很少，特別在水稻害蟲中，該類蛋白的結構和功能都是未知，有待研究。

白背飛虱（Sogatella furcifera）為水稻重要害蟲，屬昆蟲綱半翅目飛虱科［14］。成蟲前胸背板以及中胸背板均為白色，其名由此而來［15］。白背飛虱整個生活史包括卵、若蟲和成蟲3個階段，屬于不完全變態，成蟲有翅二型現象。該研究前期已測定獲得了此蟲的轉錄組數據，比對到全長1 377 bp的tramtrack基因cDNA開放閱讀框序列（序列號c53168_c4_g1_i3），編碼由458個氨基酸組成的蛋白質，筆者在此基礎上分析白背飛虱Tramtrack蛋白的結構特點，并采用熒光定量 PCR 方法測定了該蛋白基因在受精卵和未受精卵，以及5齡若蟲不同部位的表達水平。研究結果有助于了解水稻害蟲Tramtrack蛋白的結構特點和表達水平，為進一步研究其在水稻害蟲中的生物學功能奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

蟲源采自廣州市郊外的華南農業大學實驗田，在室溫（28±2）℃、 70 %相對濕度和16 h光照：8 h黑暗的條件下進行飼養。選取交配和未交配、且腹部肥大即將產卵的雌成蟲各10頭，在體式顯微鏡下分別解剖取出已成熟的卵，放入低溫冰箱中保存待用。另外選取五齡第2天的雌若蟲10頭，先低溫冷凍處理，再用刀片將所有蟲體切成頭部、胸部和腹部，然后收集各個部位的樣品儲存在低溫冰箱中待用。以上樣品重復3次。

1.2? Tramtrack蛋白的理化性質分析

利用網上軟件 ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam.html）、SignalP-5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）和NetPhos-3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhos-3.1）對白背飛虱Tramtrack蛋白的理化性質進行具體分析。

1.3? Tramtrack蛋白的三維結構預測

在網上軟件Swiss-Model（https：//swissmodel.expasy.org/）中提交白背飛虱Tramtrack蛋白的氨基酸序列，采用同源建模法模擬構建出Tramtrack三維結構。

1.4? 定量PCR檢測

采用Trizol試劑盒（Invitrogen，美國）從受精卵、未受精卵和5齡頭、胸、腹的樣品中分別提取總 RNA，再根據PrimeScriptTM RT Master Mix（TaKaRa，日本）試劑盒的操作說明，分別反轉錄合成各樣品的cDNA。設計出Tramtrack蛋白基因的引物（F：TCCTGGTTTGAAATCCCTT；R：CAACTCACCATCGCACAAT）。內參基因為β.actin（NCBI的登錄號為NC_004354.4），試驗使用的方法為SYBR green qRT-PCR。使用2-ΔΔCT法處理相關試驗結果，數據處理和統計分析使用SPSS 26軟件。

2? 結果與分析

2.1? 白背飛虱Tramtrack蛋白的理化分析

Tramtrack蛋白理論等電點為8.24，屬于堿性蛋白。由圖1可知，白背飛虱Tramtrack為親水性蛋白。SignalP-5.0在線軟件預測分析Tramtrack的SP 信號肽值為0.000 5，沒有信號肽（圖2）。Netphos 對Tramtrack的重要磷酸化位點進行分析，結果顯示該蛋白有 42個絲氨酸、13個蘇氨酸、5個酪氨酸位點（圖3）。

2.2? 白背飛虱Tramtrack蛋白的三維結構分析

建模得到的三維結構主要由α-螺旋構成，還有少部分的β-折疊（圖4）。

2.3? 編碼Tramtrack蛋白的基因在白背飛虱卵和五齡若蟲頭、胸、腹中的表達

編碼Tramtrack蛋白的mRNA在白背飛虱受精卵中含量顯著高于未受精卵（圖5）。在白背飛虱五齡若蟲中，Tramtrack蛋白基因在胸部和腹部的表達量接近，差異不顯著，但在頭部的表達顯著升高，與在胸部和腹部的表達相比差異顯著（圖6）。

3? 結論與討論

該研究在已獲得的白背飛虱全長1 377 bp的tramtrack基因cDNA開放閱讀框序列的基礎上，對其編碼的由458個氨基酸所組成的Tramtrack蛋白的結構特點進行生物信息學分析，結果顯示，該蛋白等電點為8.24，屬于堿性蛋白，無信號肽，為親水性蛋白，有多個磷酸化位點，其三維結構主要是α-螺旋，少部分是β-折疊。這說明白背飛虱Tramtrack蛋白在結構上與其他物種的相關蛋白類似，進一步說明該類蛋白在不同物種中具有高度保守性［2］。這是第一次有關水稻害蟲稻飛虱的Tramtrack蛋白的研究報道，為今后具體探究該蛋白在水稻害蟲中的具體功能角色提供前期基礎。

定量PCR檢測表明在白背飛虱受精卵中tramtrack基因的表達明顯高于未受精卵。由于卵內mRNA均來源于母體［16］，推測交配受精行為可能會增強母體tramtrack基因的表達，故受精卵中tramtrack的mRNA量高于未受精卵。具體情況還有待進一步證實。此外，定量PCR檢測還發現tramtrack基因在五齡若蟲頭部表達顯著高于在胸部或腹部表達。這與已有報道認為這個基因主要在頭部神經系統表達和發揮作用相一致［8，10］。

參考文獻

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