黃微孢屬真菌改善鹽堿脅迫下綠豆生長作用分析

馬晨曦 張 瑜 孔德馨 高 穎 徐利劍 孟 威*

（1.東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室（東北林業大學），哈爾濱 150040； 2.黑龍江大學現代農業與生態環境學院，哈爾濱150080）

鹽堿地是我國極為重要的后備耕地資源，通過技術手段提高植物適應鹽堿地的能力是鹽堿地開發利用的重要手段［1］。植物與有益微生物共生是提高植物耐鹽堿能力重要途徑之一［2-3］。鹽堿脅迫下，植物共生真菌能夠改變根系結構、將Na+外排、限制Na+向地上組織運輸、維持K+穩態、提高寄主植物營養元素吸收，以及水分運輸能力、保護光合作用系統、降低植物體內活性氧積累、增加以脯氨酸和可溶性糖為代表的滲透物質含量，從而降低氧化和滲透脅迫損傷［4-8］。因此，挖掘更多的有益真菌資源用于提高植物耐鹽堿能力將為提升鹽堿地的利用力度提供支持。

綠豆（Vigna radiata）是豆科（Fabaceae）豇豆屬（Vigna）一年生草本植物，是我國傳統雜糧植物。綠豆營養豐富，具高蛋白、高淀粉、高纖維、高礦物質元素和維生素且低脂肪特點。此外，它富含總多酚、總黃酮和多糖等活性物質，在抗氧化、降血脂、調節血糖等方面發揮作用［9］。在中國南北各地均有種植綠豆廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區，中國是綠豆的主要出口國之一。盡管綠豆具有一定耐鹽性，但是鹽脅迫依然會通過降低種子發芽率、根冠長、鮮質量和幼苗活力等方式導致綠豆產量顯著下降［10］。

黃微孢屬（Parametarhizium）是2021 年從中國東北森林凋落物中分離培養出來的1 個子囊菌門（Ascomycota）麥角菌科（Clavicipitaceae）新菌屬，包含2 個新物種，根據其樣品來源地，分別命名為長白黃微孢菌（P.changbaiense）與興安黃微孢菌（P.hingganense）［11］。研究發現興安黃微孢菌可以定殖于綠豆根表面及細胞間隙，形成共生關系，促進綠豆生長并提高對立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的綠豆猝倒病的抗病性［12］。然而，黃微孢屬真菌是否像其近緣屬綠僵菌屬（Metarhizium）真菌一樣具有提升植物耐非生物脅迫能力，尤其是抗鹽堿脅迫，尚不明確。

為了研究黃微孢屬真菌是否能夠提高植物耐鹽堿脅迫能力，本研究對黃微孢屬真菌處理后的綠豆植株分別進行不同濃度的鹽堿脅迫處理，分析植株表型和光合特性差異，檢測滲透性調節物質、活性氧含量、脂質過氧化程度及保護性酶活性變化，明確黃微孢屬2種真菌是否能夠改善鹽堿脅迫下綠豆生長，為開發黃微孢屬真菌作為鹽堿地植物有益真菌菌劑提供理論基礎，同時為利用鹽堿地進行綠豆種植提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

綠豆品種為綠豐2號，由黑龍江省農業科學研究院齊齊哈爾分院鄭旭助理研究員提供。

長白黃微孢菌（CGMCC 19144）和興安黃微孢菌（CGMCC 19143）由黑龍江大學徐利劍教授提供。

酵母麥芽浸粉培養基（Yeast extract and Malt extracts，YM）：酵母浸粉3 g，麥芽浸粉3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH為5～6。

1.2 方法

1.2.1 黃微孢屬真菌處理綠豆

黃微孢屬真菌孢子懸浮液制備：黃微孢屬真菌在YM 培養基上室溫生長14 d。將2 mL 無菌水加入至平板，用無菌棉簽刮蹭表面，在新YM 培養基上進行Z 字型涂抹，室溫培養7～10 d。將30 mL無菌水倒入平板，用棉簽充分刮蹭表面，將孢子懸浮液用無菌雙層紗布過濾，使用血球計數板將孢子懸浮液定量為1×108個·mL-1。

挑選大小一致、飽滿的綠豆種子，真菌處理組用黃微孢屬真菌孢子懸浮液浸泡（以孢子液剛沒過種子為標準），未處理組用無菌水浸泡。種子在黑暗條件下25 ℃浸泡24 h 后轉移至16 h 晝/8h 夜光周期條件下繼續在孢子液中培養至胚根長度為1.5 cm。挑選長勢一致的綠豆種植于裝有滅菌土壤（V（腐殖土）∶V（蛭石）=1∶1）的花盆（外徑7.4 cm×高6.2 cm）中，每盆種植1 棵幼苗，每種處理種植28盆。在25 ℃，16 h晝/8h夜光周期條件下培養。

1.2.2 鹽、堿脅迫處理

鹽堿脅迫處理參照劉杰等［13］方法。按照摩爾比n（NaCl）∶n（Na2SO4）=9∶1 和n（NaHCO3）∶n（Na2CO3）=9∶1 分別配置中性鹽溶液和堿性鹽溶液。中性鹽脅迫（鹽脅迫）和堿性鹽脅迫（堿脅迫）設置濃度梯度為0（對照）、15、30、45、60 mmol·L-1。15～60 mmol·L-1堿性鹽溶液pH 分別為9.55、9.54、9.53、9.50。綠豆生長至4～5 cm 時，每盆綠豆每天固定澆灌50 mL 的中性鹽或堿性鹽溶液，共處理10 d。

1.2.3 測定指標與方法

采集經0～60 mmol·L-1鹽、堿脅迫后綠豆植株地上和地下樣品，測量株高、根長和總生物量，每種處理測量10 株。利用光合儀（Li-6800，美國）測定對照和60 mmol·L-1鹽、堿脅迫綠豆植株的氣體交換參數，包括葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間二氧化碳摩爾分數（Ci）和蒸騰速率（Tr），每種處理測定20 株。光合儀測定參數設置：葉室溫度25 ℃，二氧化碳摩爾分數400 μmol·mol-1，空氣相對濕度60%～70%，光強1 000 μmol·m2·s-1。利用FluorCam葉綠素熒光成像儀（FC 800-O，捷克）對綠豆復葉葉片暗適應最小熒光（Fo）、暗適應最大熒光（Fm）和PSⅡ最大光化學效率（Fv/Fm）進行測定；測定前將植株置于黑暗中30 min，每種處理測定15株。

針對對照和60 mmol·L-1鹽、堿脅迫后綠豆植株，參照蒼晶等［14］方法對以下指標進行測定，葉綠素含量采用乙醇提取法、脯氨酸測定采用磺基水楊酸法、可溶性糖采用蒽酮法、超氧陰離子和過氧化氫含量分別采用羥胺氧化法和碘化鉀法、丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸法、POD 活性采用愈創木酚法、SOD 活性采用氮藍四唑法、CAT 活性采用分光光度法。每種處理3 個重復，每個重復由2株植物組成。

1.3 數據分析

利用Microsoft Excel 2019 及GraphPad Prism 9.5.1 整理數據和作圖，采用Two-way ANOVA 對2種真菌處理和未處理植株在鹽、堿脅迫下各指標間差異顯著性進行分析，結果用平均值±標準差表示，圖表中不同字母表示差異顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 黃微孢屬真菌處理對鹽堿脅迫下綠豆植株生長表型的影響

在無脅迫條件下，不同處理植株生長表型存在差異，其中地上及根鮮質量由高到低依次為興安黃微孢菌處理、長白黃微孢菌處理、未處理植株（見圖1），說明2 種真菌具有促進綠豆植株生長的作用，且興安黃微孢菌促生能力強于長白黃微孢菌。

隨著鹽脅迫濃度升高，未處理植株地上和根鮮質量顯著下降（P＜0.001）。盡管2 種真菌處理植株地上鮮質量顯著下降（P＜0.001），但是45～60 mmol·L-1脅迫的根鮮質量無顯著降低。與未處理植株相比，60 mmol·L-1脅迫的長白黃微孢菌處理植株地上部分鮮質量增加80.5%，根鮮質量增加30.8%，興安黃微孢菌處理植株地上部分鮮質量增加104.1%，根鮮質量增加37.7%。不同濃度鹽脅迫下各處理植株株高和根長差異較小（見圖1A，圖2A）。

隨著堿脅迫濃度升高，不同處理植株地上和根鮮質量顯著下降（P＜0.001）。與未處理植株相比，60 mmol·L-1脅迫下長白黃微孢菌處理植株地上部分鮮質量增加44.5%，根鮮質量增加43.2%，興安黃微孢菌處理植株地上部分鮮質量增加33.4%，根鮮質量增加85.5%。不同濃度堿脅迫對長白黃微孢菌處理株高和興安黃微孢菌處理根長無影響（見圖1B，圖2B）。

以上結果說明2 種真菌處理能夠不同程度地緩解高濃度鹽、堿脅迫對綠豆生長的影響，且鹽脅迫下興安黃微孢菌處理效果優于長白黃微孢菌處理，而堿脅迫下長白黃微孢菌處理對地上部分有較好的改善效果，而興安黃微孢菌處理對根生長有較好改善效果。

2.2 黃微孢屬真菌處理對鹽堿脅迫下綠豆光合作用的影響

無脅迫條件下，2種真菌處理植株總葉綠素質量分數（長白黃微孢菌：（0.680±0.005） mg·g-1；興安黃微孢菌：（0.770±0.008） mg·g-1）顯著高于未處理植株（0.570±0.007） mg·g-1）（P＜0.001），并且興安黃微孢菌處理顯著高于長白黃微孢菌處理（P＜0.001）。2 種真菌處理植株凈光合速率（Pn）、胞間二氧化碳摩爾分數（Ci）、氣孔導度（Gs）和蒸騰速率（Tr）顯著增加，其中，Pn、Gs和Tr約為未處理植株2 倍（見表1）。鹽、堿脅迫下各處理綠豆植株Pn、Ci、Gs和Tr均呈下降趨勢，但是2 種真菌處理植株以上各項指標均顯著高于未處理植株（P＜0.001），其中鹽脅迫下各指標能夠維持與無脅迫下未處理植株相近水平。鹽、堿脅迫下2種真菌處理植株Pn仍顯著高于無脅迫下未處理植株水平（P＜0.001），鹽脅迫下2 種真菌處理植株Pn無顯著差異，但堿脅迫下長白黃微孢菌處理植株Pn顯著高于興安黃微孢菌處理植株（見表1）。

表1 鹽堿脅迫下黃微孢屬真菌處理對植株光合指標的影響Table 1 Effects of the treatment of fungi from Parametarhizum on the photosynthetic indexes under salt and alkali stress

無脅迫條件下，真菌處理植株PSⅡ潛在活性（Fv/Fo）顯著增加，PSⅡ最大光化學效率（Fv/Fm）無顯著差異。盡管鹽、堿脅迫使不同處理植株Fv/Fo和Fv/Fm比值下降，但2 種真菌處理植株Fv/Fo和Fv/Fm比值仍高于未處理植株（P＜0.001），并且鹽脅迫下興安黃微孢菌處理植株Fv/Fm比值顯著高于長白黃微孢菌處理（P＜0.001），堿脅迫下長白黃微孢菌處理植株Fv/Fo和Fv/Fm比值顯著高于興安黃微孢菌處理植株和未處理植株（P＜0.001）（見圖3）。

圖3 鹽堿脅迫下黃微孢屬真菌處理植株葉綠素熒光Fig.3 Chlorophyll fluorescence of plants treated with fungi from Parametarhizum under salt and alkali stress

2.3 鹽堿脅迫下黃微孢屬真菌處理綠豆植株滲透調節物質含量變化

無脅迫條件下2 種真菌處理植株根部脯氨酸質量分數顯著高于未處理植株（P＜0.001），地上部分差異較小，興安黃微孢菌處理植株脯氨酸質量分數顯著低于其他2 種處理（P＜0.001）（見圖4A），而不同處理間可溶性糖質量分數無差別（見圖4B）。鹽脅迫使各處理脯氨酸質量分數均顯著增加（P＜0.001），然而2 種真菌處理植株地上部分脯氨酸質量分數均顯著高于未處理植株，長白黃微孢菌處理下增加了26.2%，興安黃微孢菌處理下增加了43.1%。與未處理植株根部脯氨酸質量分數相比，興安黃微孢菌處理下增加了50%，長白黃微孢菌處理植株無顯著變化（見圖4A）。可溶性糖質量分數則無顯著變化（見圖4B）。堿脅迫同樣導致各處理脯氨酸質量分數顯著增加。盡管2 種真菌處理植株脯氨酸質量分數均顯著高于未處理植株，但是長白黃微孢菌處理植株地上部分約為未處理植株2 倍（見圖4A）。長白黃微孢菌處理植株地上部分可溶性糖質量分數同樣顯著高于未處理植株（P＜0.001）（見圖4B）。

以上結果表明，2種真菌處理能夠影響植株滲透調節物質含量，興安黃微孢菌處理導致鹽脅迫下根部脯氨酸積累，而長白黃微孢菌處理提高堿脅迫下地上部分脯氨酸和可溶性糖積累水平。

2.4 鹽堿脅迫下黃微孢屬真菌處理綠豆植株活性氧及抗氧化酶含量變化

無脅迫條件下，除興安黃微孢菌處理植株地上部分H2O2含量顯著低于其他兩種處理之外，2種真菌處理植株O·-2與H2O2含量與未處理植株無顯著差異。鹽脅迫興安黃微孢菌處理植株地上部分O·-2與長白黃微孢菌地上部分H2O2含量顯著低于未處理植株（P＜0.001）。與鹽脅迫相比，堿脅迫顯著誘導未處理植株O·-2與H2O2積累，但2 種真菌處理植株整體O·-2和根部H2O2水平顯著低于未處理植株（P＜0.001）（見圖5A～B）。MDA 含量分析顯示，盡管無脅迫條件下興安黃微孢菌和長白黃微孢菌處理植株地上部分顯著高于未處理植株，但鹽、堿脅迫下兩種真菌處理植株整體MDA 水平顯著低于未處理植株（P＜0.001）（見圖5C）。

圖5 鹽堿脅迫下黃微孢屬真菌處理植株活性氧、MDA含量及抗氧化酶活性Fig.5 Contents of ROS，MDA and antioxidant enzymes activities of plants treated with fungi from Parametarhizum under salt and alkali stress

2 種真菌處理對抗氧化酶活性也有不同程度影響，無脅迫下POD無顯著變化，但根部SOD和地上部分CAT 活性顯著升高（P＜0.001）。鹽、堿脅迫導致各處理整株POD、SOD 和根部CAT 活性增加，但兩種真菌處理植株鹽脅迫下SOD 活性和地上部分CAT 活性顯著高于未處理植株，堿脅迫下兩種真菌地上部分SOD 活性和長白黃微孢菌處理根部POD、SOD活性顯著高于未處理植株（P＜0.001）（見圖5D～F）。綜合以上結果說明，鹽、堿脅迫下兩種真菌處理植株活性氧水平和脂質過氧化程度較低，POD、SOD 和CAT 活性在鹽堿脅迫下均有不同程度地改變。

3 討論

隨著鹽堿地綜合利用力度加大，大量適應鹽堿地環境的微生物資源被開發利用，在生態環境修復和農業生產中發揮重要作用［15］。本研究發現來自中國東北森林凋落物的興安黃微孢菌和長白黃微孢菌處理綠豆種子后，能夠改善后期植株在鹽、堿脅迫下的生長。

3.1 黃微孢屬真菌處理改善綠豆對鹽堿脅迫的生理生化響應

鹽堿環境對植物的脅迫體現在生物量下降、光合作用減弱、離子動態平衡紊亂、膜透性增加等方面［2］。在本研究中，2 種黃微孢屬真菌處理植株在無脅迫條件下光合氣體交換參數（凈光合速率、胞間二氧化碳摩爾分數、氣孔導度、蒸騰速率）、葉綠素含量、PSⅡ潛在活性和最大光化學效率顯著提升且趨勢一致，說明2種真菌處理可以提升綠豆光合能力，并可能為生物量顯著提升提供基礎。在鹽脅迫下，盡管2種真菌處理植株光合氣體交換參數出現下降，但能夠維持與無脅迫條件下未處理植株相似水平，堿脅迫下長白黃微孢菌處理凈光合速率依然維持高于興安黃微孢菌處理和未處理植株水平，意味著2種真菌處理可能緩解了氣孔限制所導致的光合作用下降。與此同時，2種真菌處理減緩鹽、堿脅迫下PSⅡ潛在活性和最大光化學效率下降。以上研究結果與叢枝菌根真菌和外生菌根真菌共生的植物表現一致。鹽脅迫下叢枝菌根真菌提高植物光合速率、葉綠素熒光和含量、氣孔導度、抗氧化代謝及維護離子平衡等［5，7，16］。外生菌根真菌（Scleroderma bermudense）與海葡萄（Coccoloba uvifera）共生，通過提高氣孔導度和氣體交換能力來提高鹽脅迫下植物的光合能力［17］。厚環乳牛桿菌（Suillus grevillea）與美味牛肝菌（Boletus edulis）與蒙古櫟（Quercus mongolica）共生同樣能夠緩解鹽脅迫下植物葉片損傷并保持較高光合活性［18］。由此可見，黃微孢屬2種真菌可能利用與叢枝菌根真菌和外生菌根真菌相似的策略維護光合能力改善鹽堿脅迫下綠豆的生長。

黃微孢屬與綠僵菌屬具有較近的親緣關系［11］。鑒于二者位于一個單系類群且具有相似的殺蟲活性和促生能力等［11-12］，黃微孢屬真菌可能具有其他與綠僵菌屬真菌相似的功能。金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）LHL07 接種大豆（Glycine max）后能有效促進莖生長，干質量和鮮質量增加，葉綠素含量、呼吸速率、光合速率和葉面積增加。在NaCl 引起的鹽脅迫下，LHL07 接種的大豆植株具有較高脯氨酸含量和SOD 活性以及MDA 水平，說明金龜子綠僵菌LHL07 能夠有效緩解鹽脅迫對大豆植株的損傷［19］。在本研究中，通過對表型、光合作用相關指標，以及滲透和氧化脅迫相關指標分析得出黃微孢屬2 種真菌與金龜子綠僵菌類似，均能不同程度地緩解鹽堿環境對綠豆植株的脅迫。

3.2 不同黃微孢屬真菌處理對綠豆耐鹽堿脅迫影響差異

在鹽堿脅迫下，2種真菌處理植株脯氨酸含量顯著增加，興安黃微孢菌處理根部脯氨酸含量在鹽脅迫下顯著高于長白黃微孢菌處理，而長白黃微孢菌處理地上部分脯氨酸含量在堿脅迫下顯著高于興安黃微孢菌處理。長白黃微孢菌處理地上部分可溶性糖含量在堿脅迫下顯著升高。由此可推測，盡管2種真菌均能夠通過滲透調節來改善鹽堿脅迫影響，但是它們的作用機理可能存在差異，即興安黃微孢菌可能主要影響根部，而長白黃微孢菌可能主要影響地上部分。MDA含量能夠反映脅迫下生物膜受損程度，在本研究中鹽堿脅迫下2種真菌處理植株中ROS、MDA含量顯著下降，而抗氧化酶活性不同程度上調，意味著2種真菌處理植株抗氧化脅迫能力提升，而二者間差異說明2種真菌處理植株應對氧化脅迫機制不同。

興安黃微孢菌能夠在綠豆根表面及細胞間隙定殖，與綠豆根形成共生關系，并且通過促進磷吸收和改變激素水平促進綠豆的生長［12］。在本研究中，盡管鹽、堿脅迫導致植物萎蔫并抑制植物的生長，但是與未處理植株相比，興安黃微孢菌處理植株在鹽脅迫下具有較高生物量，在堿脅迫下根部鮮質量顯著增加。以上結果說明興安黃微孢菌在高鹽堿環境下仍能夠發揮促進植物生長的作用。盡管長白黃微孢菌是否能夠與綠豆形成共生關系鮮見報道，但是在無脅迫條件下表型分析結果顯示，長白黃微孢菌能夠顯著提高根、地上部分鮮質量，說明長白黃微孢菌也具有潛在的促生能力。雖然在鹽脅迫下長白黃微孢菌的促生效果低于興安黃微孢菌，但是隨著鹽濃度升高，長白黃微孢菌對綠豆生長的改善作用逐漸顯著。相反，在堿脅迫下長白黃微孢菌處理后的綠豆在地上鮮質量、株高、光合指標和葉綠素熒光參數等方面優于興安黃微孢菌處理。綜合以上多方面結果說明，長白黃微孢菌和興安黃微孢菌可能通過不同的機制維護光合能力、提升滲透和抗氧化調節能力，進而改善鹽堿脅迫下綠豆的生長。

黃微孢屬作為子囊菌門新發現菌屬，目前只包含2個菌種，對該屬真菌生物活性的了解尚處于初始階段。因此，本研究將中性鹽和堿性鹽脅迫分開處理，預期發現2 種真菌在鹽、堿脅迫下對植物的效應和不同之處。研究結果顯示：2種真菌能夠從植物生理生化多方面減緩鹽堿脅迫對綠豆生長的影響，并且2 種真菌處理植株在鹽、堿脅迫下出現差異。盡管本研究在綠豆幼苗階段開始進行脅迫處理，并不適用于生產實踐中鹽堿地種植情況，但是本研究結果為開發利用黃微孢屬真菌作為鹽堿地有益微生物菌肥提供理論基礎。在未來研究中，將從黑龍江省鹽堿地類型出發，探索更適用于大田種植的真菌處理方式，為進一步拓展黃微孢屬真菌的適用范圍提供支持。