植物激素調控橡膠樹產排膠機制研究進展

郭冰冰 劉明洋 代龍軍 楊 洪 王立豐

（農業農村部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室，省部共建國家重點實驗室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室，特種天然橡膠加工技術創新中心，中國熱帶農業科學院橡膠研究所，海口 571101）

植物激素是植物體內合成的多種微量內源激素的總稱，對于植物生長發育、初生/次生代謝、生物脅迫和非生物脅迫響應等過程具有關鍵作用［1］。主要植物激素有茉莉酸（Jasmonic acid，JA）［2］、乙烯（Ethylene，ET）［3］、脫落酸（Abscisic acid，ABA）［4］、赤霉素（Gibberellin，GA）［5］、油菜素內酯（Brassinosteroids，BRs）［6］、生長素（Auxin）、水楊酸（Salicylic acid，SA）、細胞分裂素（Cytokinins，CTK）和獨腳金內酯（Strigolactones，SLs）九大類［7］。每大類植物激素又包含很多細分種類，例如，生長素包含吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）以及二氯苯氧乙酸（2，4-D），GA 包括GA1、GA3、GA4和GA7等。植物激素既可單獨對植物產生調控作用，又可以交互作用形式協同對植物起到疊加或者拮抗作用［8-9］，為激素精細調控植物各類生理反應奠定基礎。

天然橡膠（NR）主要是在橡膠樹（Hevea brasiliensis）乳管細胞中合成、具有高價值且目前不可替代的高分子量生物聚合物，作為原材料生產輪胎和醫用手套等多種橡膠產品。因其具有許多合成橡膠不具備的拉伸特性，所以對交通運輸、醫藥和國防事業等至關重要［10］。中國是天然橡膠最大消費國、進口國和橡膠制品第一生產大國。截至2022年底，中國橡膠種植面積為112.3萬hm2，居世界第四位，產量85.3 萬噸，居世界第五位［11］。目前，植物激素在橡膠樹幼苗組織培養［12］、生長發育、乳管分化、產膠［13］和排膠［14］等研究領域中均具有重要作用，但是內在生理和分子調控機制研究相對于模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）和楊樹（Populus tremula）等相對滯后。筆者首先簡要介紹ET、ABA、BRs和GA4種植物激素生物合成和信號轉導途徑的最新研究進展；針對橡膠產業近年來面臨的從產量需求到品質提升這一產業關鍵問題，結合筆者的研究基礎，詳細介紹植物激素在橡膠產業各應用領域的研究現狀和存在問題；最后展望植物激素生理與分子生物學研究在橡膠產業升級中的應用領域，以期為橡膠樹中的激素研究提供理論基礎。

1 橡膠樹中乙烯信號途徑研究進展

1.1 乙烯合成和信號轉導途徑

ET 是第一個以氣體分子被確定的植物激素，其功能主要是調節植物的生長、防御、成熟、繁殖和衰老過程。其合成是以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）為原料，經1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC）反應合成ET。在植物中，ACC 合成酶（ACS）和ACC 氧化酶（ACO）是ET 生物合成途徑中的2 個關鍵酶，它們在轉錄和轉錄后都受到嚴格的調控，調節乙烯的生物合成［15］。植物中可以感知乙烯的受體蛋白有5個：ETR1、ETR2、ERS1、ERS2及EIN4，對ET 信號轉導過程起負調控作用，主要定位在內質網膜上［16］。CTR1 是ET 信 號 途 徑 中 的 抑 制 因 子［17］，EIN2是乙烯信號轉導中的關鍵組分［18］，EIN3/EIL1蛋白存在于細胞核中，是乙烯信號途徑中的關鍵轉錄因子［19］，可對下游的乙烯應答因子（Ethylene response factor，ERF）進行調控［20］。

1.2 乙烯利對橡膠樹的作用機制解析

作為乙烯的釋放劑，乙烯利（Ethephon 或Ethrel，ETH）是被廣大膠農認可的一種非常有效的橡膠樹采膠刺激劑，也是國際上增加橡膠樹膠乳產量的常用化學試劑。在橡膠樹中相繼鑒定了EIN3/EIL1基因家族和下游靶蛋白，HbEIN3 蛋白可以與含有ERE 及G-box 順式元件的啟動子結合調控下游應答基因，并且不同濃度ETH 刺激可以短時間內提高膠乳中HbEIN3蛋白積累量［21-22］。作為乙烯信號途徑的ERF 轉錄因子，其保守結構域AP2 可以識別下游靶基因來激活乙烯信號通路。巴西橡膠樹中具有完整AP2 結構域的轉錄因子有142個，參與乳管細胞分化及脅迫反應。乳管細胞水循環、活性氧的產生和清除、糖代謝，以及乳膠肌動蛋白細胞骨架的組裝和解聚可能在乙烯誘導的乳膠產量增加中起重要作用。蔗糖是天然橡膠的合成底物，外用ETH 可以增加蔗糖轉運蛋白基因的表達量以及蛋白活性，提高了光合產物向乳管的運輸，為天然橡膠的合成增添更多的底物。同時，ETH 還能提高NR 生物合成相關基因的表達量［23］，提高乳管中水通道蛋白基因HbPIP2；1及HbTIP1；1的表達量，促進乳管從周圍組織中吸水稀釋膠乳濃度，促進膠乳流動，降低膠乳堵塞指數，延長排膠時間，提高膠乳產量［24-25］。

但是，ETH 刺激不當和低溫易引起橡膠樹膠乳過度長流。我國的天然橡膠主栽區在10～12 月處于低溫季節，橡膠樹膠乳過度長流會導致橡膠樹養分的大量流失，甚至引發死皮等生理障礙。割膠后膠乳和水分的大量流失，首先導致割面受到失水脅迫，引發內源逆境相關激素合成，進一步導致活性氧增加，最終誘導橡膠樹細胞程序性死亡，導致膠乳橡膠烴分子量減少和品質下降［14］。張華林等［26］研究發現，橡膠樹新品種‘湛試327-13’兼具抗寒和高產的特性。以體積分數1.5%ETH處理橡膠樹‘湛試327-13’開割樹，連續割6刀后，證明橡膠樹活性氧淬滅酶、蔗糖轉運蛋白、膠乳抗性和橡膠生物合成關鍵酶基因在樹皮表達量高于其在膠乳中表達量。隨著割次的增加，‘湛試327-13’樹皮脂肪氧化酶基因（HbLOX1）和過氧化物酶基因（HbPOD1）的表達量顯著上調，表達峰值為對照的22.15 倍和31.95 倍；蔗糖轉運蛋白基因HbSUT1和HbSUT2a的表達量與對照相比分別提高66.11 倍和58.50 倍；幾丁質酶基因HbCHI、葡聚糖酶基因HbGLU和橡膠素基因HbHEV的表達量分別比對照提高16.93 倍、8.09 倍和10.37 倍；橡膠生物合成關鍵酶基因HbGGPPS和HbHMGS1的表達量分別比對照提高14.71 倍和15.05 倍。說明ETH 刺激橡膠樹后，‘湛試327-13’膠乳和樹皮中活性氧淬滅酶、蔗糖轉運蛋白、膠乳防衛蛋白和橡膠生物合成關鍵酶基因表達量提高且持續時間長達6 刀（18 d），是其抗寒性和產量形成的分子基礎，亦可作為橡膠樹種質資源評價指標，用于分子輔助育種［26］。

2 橡膠樹中脫落酸信號研究進展

2.1 脫落酸合成和信號轉導途徑

ABA 是植物內源激素，調控植物脫落與休眠，控制植物生長發育及種子萌發等，因其可以使植物葉片脫落而得名，又因參與植物的非生物脅迫過程也被稱為“脅迫激素”［27］。脫落酸主要在植物的葉綠體和細胞質中合成，分為C15 直接途徑和C40 間接途徑。高等植物中主要存在的脫落酸合成路徑是C40 途徑。逆境脅迫會在不同程度上刺激植物體內ABA合成，通過促進葉片氣孔關閉，促進相關基因的表達，隨后誘導抗逆特異蛋白的合成來響應逆境脅迫。ABA 依賴型信號通路主要包括四大核心組件：ABA 受體PYR/PYL/RCAR、負調控蛋白磷酸酶PP2C 家族的A 亞族成員、正調控蛋白激酶SnRK2 和轉錄因子ABRE/ABF。正常生長條件下，PP2C 通過磷酸化來抑制SnRK2 的表達；環境脅迫條件下，胞內ABA 含量升高被PYR/PYL/RCAR 受體蛋白識別，PP2C 與受體蛋白互作抑制PP2C 蛋白磷酸化，使得SnRK2 處于激活狀態，觸發下游ABA 應答元件與bZIP 轉錄因子結合調控下游靶基因的表達。因植物抗旱性與ABA的積累量呈正相關，內源ABA 含量被作為鑒定抗旱性的指標之一。

2.2 脫落酸與橡膠樹排膠的機制研究

本課題組相繼鑒定了橡膠樹ABA信號途徑中的HbPP2C家 族［28］、HbSnRK2家族［29］和HbbZIP家族成員［30］。其中，HbPP2C家族有60 個成員，劃分為13 個亞家族。表達分析表明，40 個HbPP2C基因在橡膠樹枝條中表達量最高，在膠乳中表達量最低。此外，A 亞家族HbPP2C基因在ABA、干旱和草甘膦處理下的表達顯著增加，A、B、D 和F1 亞家族成員在高溫、低溫脅迫下的表達顯著增加。A和F1 亞家族成員的表達在植株受白粉病（Oidium heveae）感染后顯著上調，與對照相比，HbPP2C6基因的表達顯著增加33 倍。說明不同的HbPP2C亞家族基因可能在橡膠樹對植物激素的調節及對非生物和生物脅迫的反應中具有不同的作用［28］。HbSnRK2家族有6 個成員，分為3 個亞家族。通過對所有HbSnRK2基因的順式調控元件序列分析，在所有HbSnRK2基因的啟動子中發現了ABRE 和TC 富集元件，表明HbSnRK2可以被ABA 和脅迫反應調節。RT-qPCR 分析顯示，HbSnRK2.2基因在ABA 處理下的表達尤為顯著。此外，HbSnRK2.2基因對草甘膦、白粉病、熱脅迫和冷脅迫等過程均有響應，表明HbSnRK2.2基因在橡膠樹的植物激素信號傳導和應激反應中發揮重要作用［29］。HbbZIP家族成員有33個，分為10個亞家族。RT-qPCR 分析發現33 個HbbZIP主要在花中表達，其次是葉和根，在膠乳和樹皮中表達最低。ABA 處理后，這些基因表達量差異顯著，最高的HbbZIP38基因表達水平增加了約21倍，最低的HbbZIP56水平下降了21 倍。以上研究為進一步解析ABA 信號途徑的關鍵家族成員奠定了基礎。

3 橡膠樹中油菜素內酯信號研究進展

3.1 油菜素內酯合成和信號轉導途徑

目前已知有60 多種BR 類似物，根據側鏈C-24 位置上的烷基分為C-27，C-28 和C-29 三大類群。C-28 類群是植物中含量最豐富、分布最廣的BRs。BRs 的生物合成涉及平行和高度分支的通路，彼此之間呈現交互作用［31］。在擬南芥中，BRs被質膜結合的富含亮氨酸重復序列（LRR）的RLKs、BRI1及其同源物BRL1和BRL3感知。在缺乏BRs 的情況下，BRI1 激酶抑制劑1（BKI1）的負調控因子可阻止BRI1 與其共受體——BRI1 相關受體激酶1（BAK1）/體細胞胚胎發生受體樣激酶3（SERK3）的結合，從而抑制其活性。在這種情況下，1種GSK3/shaggy樣蛋白激酶，即油菜素內酯敏感蛋白2（BIN2）激活并磷酸化2 個轉錄因子，油菜素內酯抗性蛋白1（BZR1）和BRI1 EMS 抑制蛋白1（BES1）/BZR2，導致它們經蛋白酶體介導的路徑降解。結合BR 后，BRI1 與BAK1 相互作用導致它們通過磷酸化相互激活。這種反式磷酸化激活了BRI1 的激酶活性，磷酸化并激活BR 信號激酶（BSK1、BSK2和BSK3），調控下游基因響應BR［31］。

3.2 油菜素內酯促進橡膠樹排膠機制及其調控

BR 是調控植物生長發育和產量形成的重要植物激素之一。本課題組［32-34］以橡膠樹品種‘熱研73397’為研究對象，分析橡膠樹中BR 緩解水分虧缺和提高乳膠產量的效應。結果表明：BR 通過提高光合作用速率、減少滲透調節物質的滲透、增加能量物質的合成和改善抗氧化系統，提高了水分虧缺條件下橡膠樹的活力。此外，BR 在不降低膠乳硫醇、蔗糖和無機磷的情況下，通過降低堵塞指數和提高黃色體破裂指數來提高乳膠的產量和品質。RNA-Seq 分析進一步表明，差異基因編碼蛋白主要富集在MAPK 信號通路、植物激素信號轉導和蔗糖代謝這3個通路。BR 還可誘導反式玉米素、ET、SA、激動素和細胞分裂素含量提升，而對于生長素、ABA和GA無誘導作用［32-34］。

4 橡膠樹中赤霉素信號研究進展

4.1 赤霉素合成和信號轉導途徑

GA 是存在于植物中的四環二萜類化合物，具有以四環或者五環進行排列的碳骨架結構，可變的第五環是內酯，其合成分別在質體、內質網膜和細胞質3個亞細胞結構中進行。在植物、細菌和真菌中鑒定到的赤霉素有130多種，可以調節植物生長發育的有活性赤霉素只有4種：GA1、GA3、GA4和GA7［35］。赤霉素信號轉導由GA 信號受體GID1 和負調控因子DELLA 蛋白組成。GID1 是一種可溶性赤霉素受體，在細胞質上感受到GA 信號后直接與GA 相結合形成GA-GID1 復合物。然后GAGID1 復合物與DELLA 相結合，此過程有SCFGID2E3泛素連接酶復合物參與快速降解DELLA，引發下游GA 響應基因的表達。GID 編碼類似激素敏感相關的脂肪酶HSL 蛋白，含有HSL 保守基序HGG和GXSXG，但是不具有水解酶的活性，其與DELLA 的互作也要依賴GA 的存在。DELLA 對GA 信號途徑起阻遏作用，N 端具有保守DELLA 和VHYNP 結 構 域 來 推 動GID1 和DELLA 的 互 作，C 端為GRAS 結構域，包含2 個亮氨酸重復序列LHR。已知的DELLA 蛋白有RGA、RGL1、RGL2、RGL3及GAI［36］。

4.2 赤霉素促進橡膠樹排膠機制及其調控

吳紹華等［37］采用RT-PCR 與RACE 技術從橡膠樹‘熱研73397’膠乳中克隆了2 個DELLA 蛋白（HbGAI 和HbRGA1）。HbGAI的cDNA 序列全長2 050 bp，包含1 842 bp 的完整ORF，HbRGA1的cDNA 序列長為2 136 bp，含1 839 bp 的ORF，兩者的氨基酸序列都含有DELLA 和GRAS 結構域，屬于無跨膜結構域的親水性蛋白。HbGAI 和HbRGA1 蛋白與麻瘋樹（Jatropha curcas）和蓖麻（Ricinus communis）中兩者同源蛋白的親緣關系較近。RT-qPCR 分析發現膠乳中HbGAI基因的表達受割膠和茉莉酸甲酯（MeJA）處理下調，ETH 處理4 h 內顯著上調膠乳中HbGAI基因的表達，表明HbGAI基因可能在橡膠樹割膠、JA、ET 響應中發揮作用［37］。HbRGA1在橡膠樹葉片中表達量高，在樹皮和膠乳中表達量極低。葉片中HbRGA1表達量受噴施GA 和ABA 等誘導顯著上調。HbGAI和HbRGA1與橡膠樹GA 等激素信號密切相關，為深入研究其在橡膠樹生長發育中的結構和功能打下良好基礎［38-39］。

5 橡膠樹植物激素機制研究展望

5.1 建立新型橡膠樹基因功能驗證體系

鑒于植物生理和分子生物學技術進展迅速，將新型激素生理研究方法引入橡膠樹研究領域對推動橡膠產業發展具有積極作用。例如，VIGS 及轉基因技術可更加精確地定向改變植物的基因表達調控特定性狀。目前，可以用基因槍轟擊瞬時轉化橡膠樹的胚狀體與愈傷組織，并且已經在橡膠樹中以花青素為主體構建了可視化轉基因高效篩選系統。同時，VIGS 技術可以特異性降低內源基因的表達，快速誘導植物沉默基因來特異性表征基因功能。作為一項成熟快速有效的表征基因功能的技術，VIGS 可以應用到橡膠樹產排膠過程中激素信號轉導路徑關鍵基因的功能驗證研究。

5.2 橡膠樹中植物激素信號的交互作用機制解析

橡膠樹產排膠是一個復雜的生理生化過程，不是單一激素的作用，而是多種激素相互作用的結果。外源噴施MeJA 及ETH 處理都可以提高激素信號網絡途徑關鍵因子HbGSK1的表達，說明兩者具有協同調控的作用。ABA 信號途徑轉錄因子基因HbSnRK響應ET、JA、GA 和SA 等激素的誘導，乙烯信號途徑轉錄因子基因HbERF響應ABA、SA 和JA 等激素的調控，BR 信號途徑轉錄因子基因HbBES1響應ET、JA、GA、SA和ABA等激素的誘導，GA信號途徑的DELLA基因響應ABA、SA、ETH和生長素等的誘導，說明植物激素以交互方式對橡膠樹的生長發育進行調控。可以預見，橡膠樹激素生理的主要研究內容為：分析不同外源激素單獨、聯合施用或同步施用抑制劑證明激素調控膠乳產量的效應；分析不同激素信號途徑基因表達量與膠乳產量之間的相關關系；完善橡膠樹遺傳轉化體系，采用轉基因技術解析激素協同調控膠乳產量的作用機制。

5.3 挖掘和鑒定橡膠樹激素信號調控的關鍵轉錄因子

挖掘和鑒定橡膠樹激素信號調控的關鍵轉錄因子是研究激素生理與分子機制的關鍵環節。例如，在其他植物中已證明MYB-bHLH 分子模塊在調控植物次生代謝和生長發育中發揮重要作用［40］。Qin 等［41］前期研究發現橡膠樹HbMYB44基因受多種激素誘導，在橡膠草（Taraxacum kok-saghyz）中過表達HbMYB44能顯著提高轉基因植株的根部NR 含量，同時上調橡膠草中TkMYB44同源基因和bHLH13等轉錄因子基因表達。推測Hb-MYB44 蛋白既可以通過直接與NR 合成酶基因啟動子結合調控NR 合成酶基因的表達，又與HbbHLH13啟動子結合從轉錄水平調控HbbHLH13的表達，同時通過蛋白互作形成HbMYB44-HbbHLH13 復合體調控NR 生物合成。可采用BiFC、LUC 和GST pull-down 等技術驗證HbMYB44與HbbHLH13 的蛋白互作。創制過表達Hb-MYB44、HbbHLH13及共表達橡膠草進行功能驗證。采用轉錄組、代謝組、ChIP-Seq 技術系統地解析轉基因植株中NR等代謝物積累及NR合成基因表達的關系，闡明HbMYB44-HbbHLH13 分子模塊調控NR生物合成的分子機制。

總之，將植物激素信號機制原理與技術引入橡膠樹膠乳產量和品質形成的研究中，將為進一步闡明NR 生物合成的分子調控網路提供重要理論依據，為創制和選育高產優質橡膠樹新品種和研發新技術提供重要的理論基礎。