黃芩治療慢性鼻竇炎網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作用機(jī)制研究*

侯青雯，王旭，姚斌峰，李敏

1 蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 蘇州 215101； 2 南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210014

慢性鼻竇炎（chronic rhinosinusitis，CRS）是耳鼻咽喉頭頸外科的常見病和多發(fā)病，是鼻腔及鼻竇黏膜的慢性炎癥性疾病。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)CRS的平均患病率約為8.0%，其中15～75歲年齡段人群患病率為8.2%，已成為影響人們健康的常見慢性疾病之一［1］。目前，西醫(yī)治療CRS通常以糖皮質(zhì)激素、大環(huán)內(nèi)酯類藥物及抗菌藥物為主，但這些治療方式無(wú)法很好改善癥狀，患者最終選擇鼻內(nèi)鏡手術(shù)［2］。而外科手術(shù)存在創(chuàng)傷大，危險(xiǎn)因素及并發(fā)癥多等問(wèn)題，因此探究安全有效治療CRS的藥物成為目前研究的新方向。

CRS屬中醫(yī)“鼻淵”范疇，以鼻流濁涕、量多不止、鼻塞聲重、頭痛頭昏、嗅覺(jué)減退為主要臨床特征［3-4］。古代醫(yī)家根據(jù)《素問(wèn)·氣厥論篇》中“膽移熱于腦，則辛鼻淵，鼻淵者，濁涕下不止也”的論述，提出鼻淵病因病機(jī)的基礎(chǔ)在于“膽熱”，故臨床治療多從膽熱出發(fā)，以清膽通竅為主。黃芩為唇形科黃芩屬植物黃芩的干燥根，性寒、味苦，歸肺、心、肝、大腸經(jīng)，善清泄少陽(yáng)膽腑邪熱［5］。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)治療CRS經(jīng)驗(yàn)方中均含有黃芩，而且黃芩大量應(yīng)用于鼻科疾病的臨床治療［6］，但是對(duì)于黃芩治療CRS的機(jī)制尚無(wú)深入研究。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析黃芩治療CRS可能的作用機(jī)制，以期為CRS的實(shí)驗(yàn)及臨床研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黃芩活性成分篩選以“黃芩”為關(guān)鍵詞，檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP；http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）搜集黃芩活性成分［7］，建立黃芩活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù)活性成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（吸收、分布、代謝及排泄）篩選符合條件的活性成分，篩選條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（druglikeness，DL）≥0.18。

1.2 黃芩活性成分2D結(jié)構(gòu)查詢針對(duì)所篩選黃芩活性成分，利用PubChem（https：//pubchemncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)［8］，以收集活性成分的PubChem Cid為檢索條件，檢索并將活性成分名稱標(biāo)準(zhǔn)化，保存每個(gè)活性成分的2D結(jié)構(gòu)（SDF格式）。

1.3 黃芩活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)采用Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）服務(wù)器［9］，依次上傳黃芩活性成分2D結(jié)構(gòu)（SDF格式），進(jìn)行反向藥效團(tuán)匹配，點(diǎn)擊Predict targets，獲取與黃芩活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白。通過(guò)UniPort數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprt.org/）進(jìn)行靶點(diǎn)-基因名轉(zhuǎn)換并篩選出物種為“人”的靶點(diǎn)，即為黃芩主要活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.4 CRS疾病靶點(diǎn)篩選通過(guò)人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)（the human gene database，GeneCards；https：//www.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)（online mendelian inheritance in man，OMIM；http：//www.omim.org/）、DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Chronic rhinosinusitis”進(jìn)行檢索，分別獲取人CRS相關(guān)基因和蛋白靶點(diǎn)信息；應(yīng)用UniPort數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)納入的靶點(diǎn)進(jìn)行靶點(diǎn)-人類基因名轉(zhuǎn)換。整理合并轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)，刪除重復(fù)值（相同基因簡(jiǎn)稱及蛋白靶點(diǎn)信息），得到包括基因、對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)名稱及蛋白質(zhì)編號(hào)的Excel文件。

1.5 CRS靶點(diǎn)的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（proteinprotein interactions，PPl）構(gòu)建將上述靶基因取交集；將共同靶基因上傳到STRING平臺(tái)（https：//stringdb.org/）［10］獲取PPI數(shù)據(jù)。打開STRING頁(yè)面，選擇“Multiple proteins”，將黃芩預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與CRS疾病靶點(diǎn)基因復(fù)制到“List of Names”中，“Organism”中選擇“Homo sapiens”，其余參數(shù)保持默認(rèn)狀態(tài)，構(gòu)建黃芩治療CRS潛在靶點(diǎn)之間的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析將共同靶標(biāo)基因名輸入核心靶基因，導(dǎo)入基因功能注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（the database for annotation visualization and integrated discovery，DAVID；https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）在線分析工具［11］，選擇GO富集及KEGG通路富集分析功能，通過(guò)R語(yǔ)言包構(gòu)建KEGG通路富集分析中篩選的關(guān)鍵信號(hào)通路條形圖。

2 結(jié)果

2.1 黃芩活性化合物成分經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，共得到143種黃芩活性成分，篩選后得到36個(gè)潛在活性成分，其基本信息見表1。

表1 黃芩活性成分和靶點(diǎn)篩選結(jié)果（排名前36）

2.2 黃芩治療CRS的潛在作用靶點(diǎn)共檢索出36個(gè)黃芩活性成分潛在相關(guān)靶點(diǎn)，2555個(gè)蛋白靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后得到黃芩活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)445個(gè)。人類CRS相關(guān)疾病靶點(diǎn)共1240個(gè)，合并去重后獲得CRS疾病靶點(diǎn)1133個(gè)。通過(guò)Venny 2.1在線平臺(tái)（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）與Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)取交集，得到共同靶點(diǎn)129個(gè)，即為黃芩治療CRS潛在靶點(diǎn)。見圖1。

圖1 黃芩活性成分-CRS相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 “藥物-活性成分-疾病-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)“藥物-活性成分-疾病-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)中共有167個(gè)節(jié)點(diǎn)和1001條邊。圖中紅色正方形代表黃芩，綠色正方形代表疾病CRS，黃色菱形代表活性成分，黃色正六邊形代表靶點(diǎn)基因，邊代表黃芩活性成分與CRS靶點(diǎn)基因之間的相互關(guān)聯(lián)。該網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)反應(yīng)度值大小，線條個(gè)數(shù)與靶點(diǎn)作用因素成正比。提示該活性成分或靶點(diǎn)可能是網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵，并發(fā)揮著關(guān)鍵作用。見圖2。

圖2 “藥物-活性成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPl網(wǎng)絡(luò)PPI網(wǎng)絡(luò)中包含128個(gè)靶蛋白節(jié)點(diǎn)，1756條相互作用連線。連接度即度值是指PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)所通過(guò)的邊的個(gè)數(shù)。度值越大代表此節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的關(guān)系更緊密，在網(wǎng)絡(luò)中所處地位越重要。以“節(jié)點(diǎn)連接度”的中位數(shù)為卡值，選取中藥靶標(biāo)-疾病基因互作網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)，同時(shí)以度中心性、接近中心性和中介中心性的中位數(shù)為卡值，進(jìn)行兩次篩選，得到靠前的10個(gè)靶點(diǎn)蛋白網(wǎng)絡(luò)，包含10個(gè)節(jié)點(diǎn)和45條邊。圖中節(jié)點(diǎn)代表蛋白，節(jié)點(diǎn)連接邊的個(gè)數(shù)越多，代表該節(jié)點(diǎn)的度越大。圖中邊代表蛋白之間相互作用強(qiáng)弱，邊越粗代表蛋白之間的相互作用越強(qiáng)。該網(wǎng)絡(luò)中度值最高的靶蛋白為GAPDH，度值為100，其次為Akt1、CASP3、TNF、STAT3、EGFR、SRC、HSP90AA1、MAPK8、PTGS2，這些靶蛋白與其他蛋白相互作用，在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。這些度值較高的靶蛋白可能是黃芩治療CRS的關(guān)鍵靶點(diǎn)。見圖3—4。

圖4 黃芩治療CRS關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.5 GO和KEGG通路富集分析GO富集分析中，根據(jù)P值（P＜0.05）篩選出353個(gè)生物過(guò)程，其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ促進(jìn)劑轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化，藥物應(yīng)答、細(xì)胞增殖正調(diào)控、炎性反應(yīng)、肽基酪氨酸磷酸化、細(xì)胞增殖、蛋白質(zhì)自磷酸化等位于GO生物過(guò)程前列。可見，CRS的發(fā)生發(fā)展涉及炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)磷酸化、細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)節(jié)等生物過(guò)程，而黃芩可通過(guò)調(diào)節(jié)以上生物過(guò)程治療CRS。KEGG通路富集分析，根據(jù)P值（P＜0.05）共得到70條通路。去除胰腺癌、丙型病毒型肝炎、急性粒細(xì)胞白血病、麻疹等具體疾病及其他無(wú)關(guān)條目后，得到48條通路，核心通路主要包括PI3K/Akt、RAS、Rap1、趨化因子、TNF、FoxO、HIF-1等信號(hào)通路。見圖5—6。

圖5 黃芩治療慢性鼻竇炎GO富集分析

圖 6 黃芩治療慢性鼻竇炎KEGG通路富集分析

3 討論

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)CRS的深入研究，發(fā)現(xiàn)運(yùn)用中藥及其有效成分治療CRS療效確切。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芩及其有效成分具有解熱、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用［12-15］。

本研究共篩選出黃芩素、紅花素、黃烷酮、降鈣素、黃連堿、豆甾醇等的36個(gè)黃芩主要活性成分及其預(yù)測(cè)靶點(diǎn)445個(gè)，CRS潛在靶點(diǎn)1133個(gè)，黃芩治療CRS的靶標(biāo)129個(gè)。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素具有抗炎、抗病毒、抗氧化、減弱肺組織細(xì)胞凋亡等藥理作用［16］。張洺嘉等［17］發(fā)現(xiàn)黃芩素可降低ica A和cid A基因表達(dá)，對(duì)細(xì)胞間多糖黏附素的合成和胞外DNA的釋放產(chǎn)生影響，進(jìn)而抑制金黃色葡萄球菌生物膜形成。金黃色葡萄球菌生物膜的形成與CRS的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，相關(guān)研究［18-19］通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)金黃色葡萄球菌內(nèi)毒素B可引起CRS伴鼻息肉患者鼻腔黏膜組織發(fā)生Th2/Th17炎癥反應(yīng)，釋放相關(guān)炎癥因子，引起鼻竇黏膜局部產(chǎn)生慢性持續(xù)性炎癥。黃芩的另一活性成分黃連堿具有抗菌、抗病毒作用［20］，陳漢斌等［21］在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)黃連堿可不同程度減低白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）含量，減少IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CRS患者外周血中IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2高表達(dá)［22-24］。黃連堿可以通過(guò)降低IL-1β、IL-6、PGE2和TNF-α含量治療CRS。上述研究與本研究結(jié)果相似，提示黃芩及其有效成分具有一定的治療CRS作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩治療CRS的核心靶點(diǎn)Akt1、CASP3、TNF、STAT3、EGFR、SRC、HSP90AA1、MAPK8、PTGS2與CRS關(guān)系密切，可能是黃芩治療CRS的主要靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)TNF主要由單核巨噬細(xì)胞及激活淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，是一種廣譜促炎癥活性細(xì)胞因子，TNF過(guò)量表達(dá)可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等黏附在鼻黏膜內(nèi)皮表面，損傷鼻黏膜［25］。CAO等［26］發(fā)現(xiàn)CRSwNP患者的上皮層存在著STAT3以及STAT3磷酸化形式的表達(dá)，表明其參與了CRS的病理過(guò)程。有文獻(xiàn)報(bào)道表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）參與了氣道慢性炎性過(guò)程，EGFR在上氣道黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)失衡，影響了鼻竇炎癥患者鼻黏膜正常修復(fù)過(guò)程［27］。MAPK8的激活可控制HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲，進(jìn)而影響基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）表達(dá)，而MMP表達(dá)失衡對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的生成與降解起作用，影響CRS組織重塑過(guò)程［28-29］。

本研究將得到的靶蛋白導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，得到了排名前10的信號(hào)通路，綜合有關(guān)CRS信號(hào)通路文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路參與了CRS的發(fā)病［30］。與PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)聯(lián)的核心靶點(diǎn)EGFR是一種跨膜糖蛋白，為人類表皮生長(zhǎng)因子受體家族酪氨酸受體中的一員，當(dāng)EGFR配基化形成二聚體后可直接激活細(xì)胞內(nèi)區(qū)域激酶活性，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列反應(yīng)，激活PI3K［31］，PI3K激活后在其質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3［32］，PIP3與PDK1結(jié)合，促使AKT的Thr308位點(diǎn)產(chǎn)生磷酸化，導(dǎo)致Akt活化，從而激活下游PI3K/Akt信號(hào)通路［33-34］，PI3K/Akt信號(hào)通路可通過(guò)激活其下游因子GSK3β，參與細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等過(guò)程的調(diào)節(jié)。相關(guān)研究證實(shí)在CRS伴鼻息肉組中GSK3β蛋白表達(dá)及基因表達(dá)升高，GSK-3β參與CRS的炎癥和息肉過(guò)程的PI3K/Akt信號(hào)通路［35］，成為PI3K/Akt信號(hào)通路的作用點(diǎn)，從而發(fā)揮治療CRS的作用。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)黃芩治療CRS的潛在活性成分、作用靶點(diǎn)、生物通路等進(jìn)行了系統(tǒng)研究和分析。結(jié)果顯示，黃芩可能通過(guò)PI3K/Akt等信號(hào)通路發(fā)揮治療CRS的作用，為進(jìn)一步研究黃芩作用機(jī)制提供了參考，但黃芩治療CRS的具體作用機(jī)制仍需通過(guò)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。