基于GEO數據庫和生物信息學方法分析水蛭治療心肌梗死的差異靶基因和信號通路*

盧麗穎，鄭景輝，徐文華，楊文娜，李麗娟

廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530011

水蛭是我國傳統的名貴中藥材，是經典的活血化瘀類蟲藥。2015年版《中華人民共和國藥典》［1］記載：水蛭具有破血通經、逐瘀消癥的功效，常用于治療血瘀經閉、癥瘕痞塊、中風偏癱、跌撲損傷等。張錫純描述水蛭為“水蛭破瘀血而不傷新血，純系水之精華生成，于氣分絲毫無損，而瘀血默消于無形，真良藥也”［2］。名老中醫楊牧祥認為水蛭祛瘀之力較強，且破瘀血而不傷新血，故常以水蛭治療病機屬瘀血阻滯證患者［3］。顏德馨老中醫也常以水蛭一藥祛除瘀血，治療疑難痼疾［4］。

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是由于動脈內壁形成斑塊，導致流向心臟的血流減少，并因供氧不足而導致心肌壞死。各類心血管疾病都易發生MI。目前，心血管疾病已成為導致我國城鄉居民總死亡率升高的主要原因之一，并已成為重大的公共衛生問題［5］。盡管臨床已有針對MI的指南推薦相關療法，但患者出院后復發的風險仍在增加［6］。MI屬中醫學“真心痛”“胸痹”等范疇，常合并心悸、心衰等，以血瘀、痰濁兩種證型最常見［7］。水蛭作為傳統的活血化瘀藥，常用于治療心血管疾病。生物信息學分析是運用新的高通量分子生物技術收集并分析大量組學數據，進而在數據研究基礎上對生物醫學問題進行研究，可用于探究中藥治療疾病的分子機制及與相關基因之間的關聯性。本研究基于基因表達綜合數據庫（gene expression omnibus，GEO）和網絡藥理學，分析MI差異表達的靶點，并分析水蛭的主要活性成分及作用靶點，探究其治療MI的作用機制，為水蛭現代藥理研究和臨床運用提供一定的參考依據。

1 資料與方法

1.1 Ml差異靶基因篩選通過GEO數據庫篩選MI的差異靶基因，在NCBI網頁（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下拉框中選擇“GEO DataSets”，并在檢索框中輸入“Myocardial infarction”，限定Manage Filters為“Homo sapiens”，Entry type為“Series”。閱讀題目和摘要，篩選與本研究相關的內容，并用GEO2R在線工具進行差異靶基因篩選。差異靶基因篩選條件以P＜0.05（-logP=1.301），|logFC|＞1為標準。

1.2 水蛭活性化合物及其靶基因篩選通過中醫藥綜合數據庫（traditional Chinese medicine integrated database，TCMID）（http：//119.3.41.228：8000/tcmid/）檢索與水蛭相關的化合物。以“SHUI ZHI”為檢索詞，檢索與水蛭相關的化合物，并將檢索得到的化合物上傳至比較毒理基因組學數據庫（comparative toxicogenomics database，CTD）（http：//ctdbase.org/）、Swiss Target Prediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、BATMAN數據庫（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），篩選水蛭活性化合物相關靶點。

1.3 水蛭治療Ml的差異靶基因分析及關鍵基因篩選將水蛭活性化合物靶點與MI差異表達的靶點進行映射，并構建韋恩圖（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）。存在交集的共同靶點可能是水蛭治療MI差異表達的靶點。將得到的差異表達靶點導入STRING數據庫（https：//string-db.org/），將研究物種限定為“Homo sapiens”，設定蛋白之間相互作用的結合分數≥0.4，進行蛋白-蛋白互作網絡（proteinprotein interactions，PPI）分析。使用Cytoscape軟件對PPI圖進行可視化分析，并使用MCODE插件分析PPI圖中的共表達基因，使用Cytohubba插件中MCC算法篩選連通度最大的前10個基因作為關鍵基因。

1.4 基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析將核心靶基因導入基因功能注釋數據庫（the database for annotation visualization and integrated discovery，DAVID） 6.8數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）對差異表達的靶點進行生物信息學分析，用Gene Symbol格式將水蛭治療MI差異表達的靶點導入DAVID 6.8數據庫中進行GO和KEGG富集分析。GO分析包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞成分（cellular component，CC）。GO和KEGG富集分析的篩選條件為P＜0.05。

2 結果

2.1 Ml差異靶基因通過GEO數據庫共檢索得到281個潛在相關系列，經閱讀題目和摘要，篩選得到2個與MI相關系列（GSE29111、GSE83500），104062個基因。使用GEO2R在線工具進行差異靶基因篩選，根據篩選標準（P＜0.05，|logFC|＞1）共篩選出794個差異基因，包括386個下調基因，408個上調基因，去除重復靶點后獲得770個唯一靶點。見圖1。

圖1 MI差異基因表達譜火山圖

2.2 水蛭的活性化合物及其靶基因通過檢索TCMID數據庫，共檢索到水蛭相關化合物35個，11個未知化合物，最終得到有效化合物成分24個，獲取803個靶點，去除重復靶點后共獲得518個相關靶點。見表1。

表1 水蛭化合物及其相關靶點來源

2.3 水蛭治療Ml的差異基因分析及關鍵基因篩選將水蛭化學成分靶點與MI差異表達靶點進行映射，并構建韋恩圖，見圖2。共得到28個水蛭治療MI差異表達的基因，分別是MMP2、ADAM12、IGF1、MAOA、EDNRA、PTGER1、FGFR2、AMY2A、ESR1、VEGFA、AREG、CA12、CPA1、PPARA、AMY1A、MAOB、PPM1B、Akt2、EGFR、KDM4C、THBS1、MYCN、CFTR、NR1H4、TYR、PDGFRA、ESR2、FGF23。將28個差異表達的基因導入STRING數據庫進行PPI分析，并用Cytoscape軟件進行可視化分析，見圖3。MCODE插件分析得到2個基因簇群，第一個簇群包括6節點，12條邊；第二個簇群包括5個節點，6條邊。利用Cytohubba插件中的MCC算法篩選出10個關鍵基因，分別是：VEGFA、Akt2、EGFR、AREG、PDGFRA、ESR1、MMP2、FGFR2、IGF1、MYCN，其中有4個基因呈上調趨勢，6個基因呈下調趨勢，見表2。關鍵基因存在相互作用，見圖4—5。

表2 關鍵基因信息

圖2 水蛭化學成分靶點與MI差異表達靶點韋恩圖

圖3 水蛭治療MI的差異靶基因PPI圖

圖4 基因簇群圖

圖5 關鍵基因PPT網絡圖

2.4 GO和KEGG富集分析結果將28個差異靶基因導入DAVID數據庫進行GO和KEGG富集分析，共得到25個BP，包括細胞增殖正調控、從RNA聚合酶ll啟動子轉錄的正調控、細胞遷移正調控、轉錄正調控，DNA模板、磷脂酰肌醇介導的信號傳導等；5個CC，包括質膜、細胞外空間、細胞外區域、細胞表面、血小板α顆粒內腔；27個MF，包括酶結合、蛋白質均二聚活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性，配體激活的序列特異性DNA結合、類固醇激素受體活性、磷脂酰肌醇-4，5-雙磷酸3-激酶活性等。見表3。

表3 差異靶基因GO分析結果

經DAVID數據庫的pathway功能分析共得到22個P＜0.05的KEGG，包括癌癥的途徑、Rap1信號通路、蛋白聚糖在癌癥中、黑色素瘤、Ras信號通路、PI3K-Akt信號通路，見表4。這些信號通路的P＜0.05，且富集了數量不等的基因，KEGG信號通路氣泡圖，見圖6。

表4 KEGG富集分析通路

圖6 KEGG富集分析氣泡圖

3 討論

MI后發生心力衰竭仍然是致死或致殘的主要原因之一。現代醫學主要使用替羅非班、阿昔單抗等藥物抑制血小板聚集，使用硝普鈉、尼可地爾等藥物擴張微血管［8］。盡管針對MI有很多治療方案，但MI后心功能恢復及預防MI向心力衰竭轉變的方法仍未完善。中醫藥治療MI有顯著療效并能降低不良反應發生率。水蛭及其藥物制劑已被廣泛應用于各類心血管疾病中。盧健棋等［9］在不使用肝素、腸溶阿司匹林及其他抗凝藥物的情況下對急性MI的患者予水蛭注射液進行治療，發現與常規治療組相比，早期應用水蛭注射液可明顯提高冠脈再通率，降低病死率；安小軍等［10］研究表明，在常規治療的基礎上，長期服用小劑量中藥水蛭、葛根可提高陳舊性MI的治療效果，并且無不良反應發生，對預防再發MI有重要意義。

本研究基于網絡藥理學技術分析出水蛭治療MI的差異表達靶基因共28個，并利用Cytohubba中的MCC算法篩選出10個關鍵基因，分別是VEGFA、Akt2、EGFR、AREG、PDGFRA、ESR1、MMP2、FGFR2、IGF1、MYCN。其中ESR1、Akt2、PDGFRA、MYCN是上調靶點，EGFR、IGF1、VEGFA、MMP2、AREG、FGFR2是下調靶點，其中VEGFA、AREG為核心基因；EGFR是水蛭治療MI的差異表達基因，是PPI網絡中度值最大的基因，EGFR會驅動心血管疾病中的有害白細胞活性，阻斷EGFR可以抑制適應性和先天免疫驅動的心血管炎癥以及動脈粥樣硬化中泡沫細胞的形成［11］；VEGFA參與許多生理活動，與心血管疾病的發生息息相關，抑制VEGFA的異常表達對防治心血管疾病有重要意義［12］；AREG的表達能增加心肌缺血耐受性，減少MI范圍，AREG的表達量在缺血性心臟病患者心肌組織中增加，同時AREG缺乏會加重心肌缺血再灌注損傷［13］。本研究結果提示VEGFA、AREG、EGFR等基因是水蛭治療MI的重要靶點，后續的研究需要關注這些關鍵靶點。

GO分析結果可知水蛭治療MI的這些差異基因主要存在于細胞外空間和細胞外區域、血小板α顆粒內腔、質膜等細胞成分。GO分析結果提示差異表達的基因有相似的生物學過程，具有協同作用的特點，水蛭治療MI可能與成纖維細胞增殖、平滑肌細胞增殖的調控、對缺氧反應、磷脂酰肌醇介導的信號傳導這些生物功能密切相關。成纖維細胞是心肌纖維化的重要效應細胞［14］，血管平滑肌細胞可以減輕缺血再灌注損傷，改善MI后心功能［15］。與磷脂酰肌醇介導的信號傳導有關的通路主要有PI3K-Akt信號通路，PI3K和下游效應物Akt屬于信號轉導酶的保守家族，參與調節細胞活化、炎癥反應和凋亡［16］。GO分析提示水蛭治療MI在不同的細胞成分中通過干預多種生物功能達到治療效果。

KEGG分析結果提示水蛭治療MI的差異表達基因通過多個信號通路發揮作用。Rap1信號通路對于血管形成和血管生成有重要意義，Rap1通常與PKA信號共同調節通透性和細胞收縮性［17］。Rap1對于防止循環中血小板過早活化以及血管損傷部位的止血作用至關重要［18］。RAS信號通路的激活參與動脈粥樣硬化的形成［19］。RAS和PIK3CA信號對細胞增殖、分化和存活有廣泛影響，RAS或PIK3CA途徑影響酪氨酸激酶受體信號使血管異常突變［20］。RAS/MAPK通路以生長因子和小分子的形式將細胞外輸入轉導到細胞內環境，其失調是癌癥的主要原因之一。此外，在肥厚型心肌病中RAS/MAPK信號表達增加［21］。HIF-1是一種轉錄因子，作為氧穩態的主要調節因子發揮作用［22］。HIF-1通過調節血管生成和血管重塑來控制氧氣輸送，通過調節葡萄糖代謝和氧化還原穩態來控制氧氣利用，在壓力超負荷的代償性心肌肥大過程中，心肌細胞中的HIF-1活性能維持氧的穩態［23］。

綜上所述，本研究通過GEO數據庫和生物信息學研究發現，水蛭治療MI的差異基因有28個，包括VEGFA、AREG、EGFR等，其作用機制可能與調控Rap1、PI3K-Akt、Ras、MAPK、HIF-1等信號通路有關。