基于網絡藥理學探討參蛭通心膠囊核心藥對人參-水蛭治療擴張型心肌病的作用機制*

齊璐瑤，邢基祥，范吉林，侯信錚，陳昭，張世亮

1 山東中醫藥大學，山東 濟南 250014； 2 山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250014

擴張型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）是一種由不同病因引起的異質性心肌病，以心臟擴大、射血分數降低為主要臨床表現，后期常發展為心律失常、心衰、血栓栓塞甚至猝死［1］。西醫多采用心室減容、心臟再同步方法治療，后期選擇心臟移植。近年來西藥治療DCM雖然取得一定進展，但預后仍較差。有研究表明，DCM患者5年病死率約為42.24%［2］。

人參-水蛭是張世亮教授創制的治療胸痹、心悸等氣虛血瘀證的代表方參蛭通心膠囊的核心藥對，臨床觀察發現該藥在增強心肌收縮功能、改善心衰、對抗心律失常、預防血栓栓塞和猝死等方面具有重要作用。人參為補益氣血要藥，人參中的多種人參皂苷和人參多糖被現代藥理證實具有增強心肌收縮、提升動脈血流量、對抗休克發作及心律失常、降脂、抗動脈硬化、抑制血栓形成等作用。水蛭可破瘀通閉，行水道，水蛭素是凝血酶特異性抑制劑，具有擴張毛細血管、緩解小動脈痙攣和降低血液黏著力的作用［3］，還可抑制膽固醇與脂肪酸合成有關酶的表達及活性，調節脂質代謝，對血栓形成起預防作用［4-5］。通心絡膠囊中人參-水蛭被用作預防心血管疾病不良預后的主要藥物。

網絡藥理學是基于生物學和藥理學等多種理論體系，從多視角闡明藥物、成分、靶點和疾病之間的協同效應和潛在機制。其整體性、系統性完美契合了中藥多成分、多靶點、多渠道治療疾病的方式和中醫藥整體觀及辨證論治特色［6］。本研究基于網絡藥理學系統分析參蛭通心膠囊核心藥對人參-水蛭治療DCM的作用機制，以期為指導臨床和今后的深入研究提供思路和理論依據。

1 研究方法

1.1 人參-水蛭藥對成分與靶點獲取通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP；https：//tcmspw.com/tcmsp.php）以“人參”為關鍵詞檢索并選取口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18的活性成分，進而預測其作用靶點；通過BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數據庫以“水蛭”為關鍵詞，將分數截止值設置為20，調整后P值設置為0.05，檢索其活性成分，預測水蛭作用靶點。將人參-水蛭藥對潛在靶點導入UniProt（https：//www.uniprot.org/）數據庫，對基因進一步標準化處理，最終獲得人參-水蛭藥對的基因靶點。

1.2 DCM靶點獲取檢索人類基因數據庫（the human gene database，GeneCards；https：//www.genecards.org/），檢索關鍵詞“Dilated cardiomyopathy”，獲得DCM的已知靶點。

1.3 人參-水蛭藥對治療DCM靶點獲取運用Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）平臺將人參-水蛭藥對的基因靶點與DCM的已知靶點取交集，得到人參-水蛭藥對治療DCM的潛在作用靶點。

1.4 人參-水蛭藥對成分及其與DCM對應靶點網絡構建將人參-水蛭藥對的成分及藥對與DCM的交集靶點導入Cytoscape3.7.2軟件，構建其“藥物-疾病-成分-靶點”網絡，節點代表人參-水蛭、人參-水蛭藥對成分、DCM、藥物與疾病的交集靶點，邊代表人參-水蛭與其成分、人參-水蛭成分與交集靶點、DCM與交集靶點之間的相互作用。

1.5 蛋白-蛋白互作網絡（protein-protein interactions，PPl）與核心靶點圖的制作將藥物-疾病交集靶點導入STRING（https：//stringdb.org）數據庫，選取物種為“人”（Homo sapiens），規定minimum required interaction score＞0.4，構建藥物-疾病PPI網絡。將STRING分析出的數據導入Cytoscape 3.7.2軟件，選取Degree值大于平均值及以上的靶點構建核心靶點網絡。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析將藥物-疾病交集靶點導入基因功能注釋數據庫（the database for annotation visualization and integrated discovery，DAVID；https：//david.ncifcrf.gov），選擇“OFFICE_GENE_SYMBOL”選項，將物種限定為“人”（Homo sapiens）。以P≤0.05為條件篩選得到人參-水蛭藥對治療DCM的生物過程及相關通路。利用OmicShare（https：//www.omicshare.com/）云平臺，導入篩選得到的數據，通過分析人參-水蛭藥對作用于DCM的生物過程和通路傳導過程，得到GO氣泡圖和KEGG條形圖。

2 結果

2.1 人參-水蛭藥對有效成分篩選結果共得到人參活性成分190個，符合篩選條件的有效成分共22個；水蛭有效成分13個。最終得到人參-水蛭藥對潛在有效成分共35個，主要有豆甾醇、β-谷甾醇、山柰酚、人參皂苷Rh2、梔子苷、京尼平苷、D-甘露醇、西紅花酸、熊果酸等。見表1—2。

表1 水蛭活性成分

表2 人參活性成分

2.2 藥物-疾病交集靶點在人參-水蛭藥對35個潛在有效成分中，通過UniProt數據庫找到人類相關基因靶點391個，通過GeneCards數據庫找到DCM靶點3378個，最終得到人參-水蛭藥對與DCM的共同靶點184個。見圖1。

圖1 藥物-疾病交集靶點Venn圖

2.3 人參-水蛭藥對成分及其與DCM對應靶點網絡人參-水蛭與DCM的“藥物-成分-疾病-靶點”網絡中共有222個節點（其中DCM1個，人參、水蛭各1個，共同靶點184個，活性成分35個）。圖中紅色代表人參成分，綠色代表水蛭成分，黃色代表藥物-疾病共同靶點，藍色代表人參-水蛭和DCM。見圖2。

圖2 藥物-成分-疾病-靶點網絡

2.4 PPl網絡與核心靶點網絡藥物-疾病PPI網絡中共有184個節點，1656條邊，Degree平均值為18，圖中節點代表蛋白質，邊代表蛋白質與蛋白質的聯系。以平均Deree值為18，Degree值大于25為條件篩選核心靶點，制作核心靶點網絡，圓形從大到小代表Deree值由高到低，Degree值越高表明越有可能是人參-水蛭藥對治療DCM的關鍵核心成分。這些核心靶點主要有胰島素、白蛋白、腫瘤壞死因子、內皮一氧化氮合成酶、白細胞介素1β等。見圖3—4。

圖4 藥物-疾病核心靶點網絡

2.5 GO功能與KEGG通路富集分析GO分析主要包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組成（cellular component，CC）分析，設置BP、CC、MF及KEGG的P值、FDR均小于0.05，得到204條BP，40條CC、42條MF和79條KEGG通路。各選取BP、CC、MF前20條結果，利用OmicShare繪制氣泡圖，見圖5—7。氣泡面積越大代表目標基因集中于term的基因越多，氣泡顏色越深表示富集程度越高。KEGG分析前20條通路名稱、基因數量，應用-log（p）分析制作成條形圖，見圖8。

圖5 BP分析氣泡圖

圖6 CC分析氣泡圖

圖7 MF分析氣泡圖

圖8 KEGG富集通路分析結果

BP主要有藥物反應、一氧化氮生物合成過程的正調控、細胞間信號傳遞、對凋亡過程的負調控等。CC主要在細胞膜、細胞外間隙、電壓門控鈣通道復合體等。MF主要與藥物結合、類固醇激素受體活性、蛋白結合等有關。信號通路主要包括cAMP信號通路、鈣信號通路、逆行內源性大麻素信號轉導通路、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）能突觸通路等。

3 討論

DCM屬中醫“心脹”范疇，涉及的臟腑以心為主，旁及脾、肺、腎、肝等。DCM以心氣虛為本，瘀血、水濕、邪毒為標，心氣虛無力行血而致瘀，虛實相互搏結演變為氣虛血瘀病機，后因病程遷延，心氣虛加重，從而大氣下陷，氣血失調［7］，治以補氣活血，養血通脈。

本研究共收集到人參-水蛭藥對35個有效成分，其中豆甾醇具有抗氧化、抗炎癥、降低膽固醇、鎮痛、抗糖尿病、保護精神狀況、抗腫瘤等作用［8］。β-谷甾醇可通過調節局部免疫功能、抑制前列腺素合成、增強巨噬細胞活性、減少炎性因子［如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）］的分泌等來發揮抗炎作用［9-11］，同時抑制血管內皮細胞黏附分子及其在細胞內的表達，抑制動脈硬化，保護心臟［12］；山柰酚可抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒等，一定程度上可對抗腦缺血再灌注引起的神經炎癥損傷［13］；人參皂苷Rh2可調節腫瘤免疫，產生免疫因子，提高機體免疫應答；又可抑制免疫亢進［14］，促進中腦動脈閉塞大鼠血管新生，激活Keap1/Nrf2信號通路、提高抗氧化酶的活性從而抑制氧化應激反應［15］；梔子苷是一種抗炎物質，可通過NF-κB/PI3K/Akt等信號通路抑制IL-1β，從而抑制小鼠脊髓細胞炎癥反應［16-17］；熊果酸、西紅花苷［18-19］及京尼平苷均具有抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡等多種生物學活性［20-22］，而炎性反應、氧化應激和繼發性細胞凋亡都是心血管疾病病理變化過程中的重要一環［23-25］，熊果酸預處理能降低急性心肌梗死大鼠左心室舒張內徑和收縮內徑，升高射血分數和每搏輸出量，降低左心室心肌梗死面積，修復心肌纖維斷裂，間質水腫，炎性浸潤等，對大鼠心功能和左心室心肌病理學改變及細胞超微結構病變具有保護作用［26］；西紅花酸在病理切片中可表現出對心肌水腫、壞死等的保護作用［27］；西紅花酸含藥血清可有效降低受試對象血液中乳酸脫氫酶、肌酸激酶、丙二醛，提高超氧化物歧化酶含量，增強細胞活力［28］；甘露醇小劑量使用能提高人體血漿滲透壓，加速組織脫水，進而降低炎性因子水平，可對包括肺臟在內的多種組織器官的急性炎癥反應具有積極改善作用［29-30］。可見，人參-水蛭各成分多通過抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡、抗水腫及免疫調節等作用于DCM的各種病理過程。

通過核心靶點網絡圖可推測人參-水蛭配伍治療DCM可能與胰島素、白蛋白、TNF、一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3）、過氧化物酶體增生激活受體γ、IL-1β等靶點相關。白蛋白為血清中高特異性、高敏感性抗氧化物質，低血清白蛋白可能是心肌梗死潛在預測指標，且心肌缺血標志物缺血修飾白蛋白也由ALB在特定條件下產生［31-32］。超敏C反應蛋白/白蛋白水平高低與心室損傷、重構程度及心功能強弱成負相關。NOS3屬NOS家族，主要通過剪切力、血管內皮和乙酰膽堿作用，釋放一氧化氮舒張血管，提高血管通暢度，活化內皮細胞并調控平滑肌細胞增殖，與多種疾病的進程相關［33］。IL-1β升高可直接抑制心肌組織或誘導炎癥反應，間接損害心肌，引起心肌肥大，加速心肌纖維化，促使心肌細胞衰亡，降低心臟供血能力，參與心衰進程［34］。心肌梗死后心室重構及心衰患者給予IL-1β拮抗劑后外周血炎癥因子下調，心功能改善，提示其可能成為臨床治療DCM的重要潛在靶點。TNF是機體內一種重要細胞凋亡調節因子，TNF水平越高，慢性心衰越嚴重，心肌、乳頭肌肌力越差。其過度升高會導致心肌細胞外間質膠原沉積及心肌組織纖維化，左室收縮減弱、心臟重構和擴張，從而加重心肌損傷和心功能惡化［35］。細胞實驗表明TNF-α對心臟衰竭及惡性病變等的發生、發展具有重要影響［36］。

GO和KEGG分析顯示多個BP、CC、MF和通路參與人參-水蛭藥對治療擴張型心肌病的過程。其中，環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）作為傳遞生命活性信息和參與物質代謝的重要組分，可正向引導心肌細胞收縮程度和存活情況，改善心功能，增加心輸出量，擴張外周血管，降低心臟前、后負荷，發揮滋養心肌、正性肌力、舒張血管、抗血液凝集和調控心率等多重作用［37-38］。張莉等［39］證實與心律失常密切相關的K+離子通道受蛋白激酶A通路調控，而蛋白激酶A是cAMP傳導通路中的一個重要組成。Ca2+信號通路在細胞存活、增殖、代謝中至關重要，與冠心病、心肌纖維化、心肌肥大在內的多種心臟病的發生關系密切［40］。對DCM患者而言，抗ADP/ATP的血清抗體可使細胞膜鈣電流及胞漿游離鈣濃度增高，進而引起心肌細胞損傷，鈣離子拮抗劑則可防止該現象［41］。逆行內源性大麻素信號轉導通路可通過拮抗CBl受體（也分布于心臟）等發揮抗炎和神經保護等作用［42］。5-HT可誘發冠狀動脈痙攣［43］，所以可通過抑制5-HT能突觸通路緩解血管痙攣。對于DCM的治療而言，人參-水蛭的主要靶點在細胞膜、細胞外間隙、電壓門控鈣通道復合體等，通過cAMP信號通路、心肌收縮信號傳導通路、鈣信號通路、多巴胺能突觸通路、逆行內源性大麻素信號轉導通路、5-HT能突觸通路等通路起到一氧化氮生物合成正調控、細胞間信號傳遞、對凋亡過程的負調控等作用。

綜上所述，參蛭通心膠囊的核心藥對人參-水蛭通過多成分、多靶點、多通路有效阻斷DCM的病因，對心臟擴大、心律失常、血栓栓塞等起有效預防和治療作用，降低猝死風險。但本研究存在一定缺陷，數據庫未考慮到藥物劑型問題，藥物進入體內方式是否會引起療效差異，而且不能預測對尚未發現的DCM發病機制是否有效等局限性。