基于TGF-β1/Smads信號通路探討大蒜素對2型糖尿病大鼠腎纖維化的影響*

白敏，李曉翠，靳世英，李慧，吳潔

邯鄲市中心醫院藥學部，河北 邯鄲 056001

高血糖所致腎纖維化是糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）的主要病理機制，也是引發腎功能降低和腎臟器質性病變的重要因素之一［1-2］。因此，以抑制腎纖維化為治療靶點對延緩DN疾病進展至關重要。轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是一種強致纖維化因子，其下游靶分子Smads能夠誘導細胞外基質表達上調，TGF-β1/Smads信號通路在組織纖維化過程中具有重要調控作用［3］。

大蒜素是天然存在于大蒜球莖中的一種具有抗炎、抗氧化等多種藥理學作用的二烯丙基三硫化物［4］。其對酒精性肝纖維化、慢性腎衰所致腎纖維化、糖尿病所致心肌纖維化均具有明顯抑制作用［5-8］，并且能夠通過調控TGF-β1/Smads信號通路減輕肺纖維化、心肌纖維化［9-10］。目前，大蒜素對2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）所致腎纖維化影響的文獻報道尚不多見，本研究旨在探討大蒜素對T2DM大鼠腎纖維化的影響及其可能的作用機制，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物50只健康清潔級雄性SD大鼠，7周齡，體質量（230±20）g，購于河北省實驗動物中心，動物生產許可證號：SYXK（冀）2018-004，清潔環境飼養1周后開展實驗，飼養條件：室溫25 ℃，相對濕度（60±5）%，保持12 h光暗循環照明，自由飲食飲水。本實驗經醫院倫理委員會審查批準［HDZXLL（K）字2020017］。

1.2 藥物與試劑大蒜素注射液（徐州萊恩藥業有限公司，批號：20200316，規格：2 mL∶30 mg）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美國Sigma公司，批號：024K1031）；24小時尿蛋白（24 hour urine protein，24h UP）、血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（serum creatinine，SCr）檢測試劑盒（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，批號分別為：202004012、202005023、202003021）；Masson染色試劑盒、二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為：G1340、DA1010）；TGF-β1、磷酸化Smad2（phospho-Smad2，p-Smad2）、磷酸化Smad3（phospho-Smad3，p-Smad3）、I型膠原蛋白（collagen I，ColI）、Ⅲ型膠原蛋白（collagen Ⅲ，Col Ⅲ）抗體和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗購自北京博奧森生物科技有限公司（批號分別為bs-0086R、bs-2224R、bs-5235R、bs-10423R、bs-0948R、bs-0294P-HRP）。

1.3 主要儀器JPS-5型血糖儀（北京怡成生物電子技術股份有限公司）；7600型全自動生化分析儀（日本HITACHI公司）；UF-1000i型全自動尿液分析儀（日本希森美康公司）；RM2245型石蠟切片機（德國Leica公司）；AU640型全自動生化分析儀、CX31型光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組、模型制備與給藥將50只雄性SD大鼠數字編碼后按隨機數字表法分為正常對照組、模型組和大蒜素低、中、高劑量組，每組10只。

1.4.2 模型制備與給藥正常對照組給予常規飼料喂養；其余各組大鼠給予高糖高脂飼料喂養4周后腹腔注射質量濃度為1%的STZ（30 mg/kg），造模成功標準［11］：72 h后檢測大鼠空腹血糖≥16.7 mmol/L，尿糖+++或尿糖++++。大蒜素低、中、高劑量組分別腹腔注射質量濃度為1、2、4 mg/mL的大蒜素溶液，正常對照組和模型組腹腔注射生理鹽水，各組注射劑量均為5 mL/kg，共干預4周。

1.5 檢測指標

1.5.1 空腹血糖水平與體質量檢測各組大鼠于末次給藥24 h后稱量體質量；經尾靜脈采空腹血，通過血糖儀測定血糖水平。

1.5.2 腎功能指標檢測末次給藥后，收集24 h尿液，離心半徑10 cm，2000 r/min離心10 min，取上清液，采用磺基水楊酸法測定24h UP；末次給藥24 h后經腹主動脈取血，離心半徑10 cm，3500 r/min離心10 min，取血清，通過全自動生化分析儀測定血清BUN、SCr含量。

1.5.3 腎組織病理學及纖維化檢查、膠原容積分數（collagen volume fraction，CVF）計算脊椎脫臼處死大鼠，取雙側腎組織。左側腎臟置于10%中性申醛溶液固定72 h，梯度乙醇脫水、二申苯透明、石蠟包埋、4 μm厚度切片后，蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色后觀察腎組織病理學改變和纖維化狀況；Masson染色觀察腎組織纖維化狀況，藍色為膠原著色。通過圖像分析系統計算CVF，CVF（%）=（膠原面積/視野總面積）×100%。

1.5.4 腎組織蛋白表達檢測取右側腎組織石蠟切片，依次經脫蠟水化、雙氧水滅活過氧化氫酶、乙二胺四乙酸修復抗原、山羊血清室溫封閉處理后，加一抗TGF-β1（1∶200）、p-Smad2（1∶200）、p-Smad3（1∶200）、ColI（1∶200）、Col Ⅲ（1∶200）4 ℃孵育過夜，PBS沖洗后加HRP標記二抗室溫孵育30 min，PBS沖洗后DAB顯色，蘇木素復染2 min，鹽酸乙醇分化后沖洗，脫水、透明處理后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察（棕褐色為陽性著色），應用Image J軟件分析視野內積分吸光度（integral absorbance，IA）和面積，以IA/面積作為目標蛋白表達的半定量結果。

1.6 統計學方法采用SPSS 13.0統計軟件分析數據，計量資料以±s表示，使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 T2DM大鼠空腹血糖水平和體質量變化情況模型組大鼠空腹血糖水平較正常對照組升高（P＜0.01），體質量較正常對照組降低（P＜0.01）；與模型組相比，大蒜素中、高劑量組大鼠空腹血糖水平降低且體質量升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖水平和體質量比較（±s）

表1 各組大鼠空腹血糖水平和體質量比較（±s）

注：與正常對照組比較，**表示P＜0.01；與模型組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

體質量（g）510.76±36.94 315.03±58.75**331.27±60.19 386.43±66.08△459.72±58.46△△組別正常對照組模型組大蒜素低劑量組大蒜素中劑量組大蒜素高劑量組鼠數10 10 10 10 10空腹血糖（mmol/L）5.72±0.80 17.43±1.41**16.68±1.47 11.97±1.25△△9.09±0.96△△

2.2 T2DM大鼠腎功能變化情況模型組大鼠24h UP和血清BUN、SCr含量較正常對照組升高（P＜0.01）；與模型組相比，大蒜素中、高劑量組大鼠24h UP和血清BUN、SCr含量降低（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠24h UP和血清BUN、SCr含量（±s）

表2 各組大鼠24h UP和血清BUN、SCr含量（±s）

注：與正常對照組比較，**表示P＜0.01；與模型組比較，△△表示P＜0.01

SCr（umol/L）25.96±3.42 52.23±5.79**47.30±5.65 41.02±4.69△△34.67±3.78△△組別正常對照組模型組大蒜素低劑量組大蒜素中劑量組大蒜素高劑量組鼠數10 10 10 10 10 24h UP（mg/24h）9.61±1.30 24.89±3.92**22.65±4.08 16.97±3.39△△12.20±2.81△△BUN（mmol/L）5.40±0.97 20.86±3.21**19.45±3.18 14.63±3.01△△9.68±1.92△△

2.3 T2DM大鼠腎組織病變情況正常對照組大鼠腎組織切片著色均勻，形態結構未見異常；模型組大鼠腎組織可見腎小球增大、系膜基質增厚、腎小管上皮細胞空泡變性、炎性細胞浸潤等病理學改變；大蒜素低劑量組大鼠腎組織病變與模型組相似，大蒜素中、高劑量組大鼠腎組織病變可見不同程度改善，其中大蒜素高劑量組可見腎小球輕度增大、少量炎性細胞浸潤，其效果優于其他組。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學變化（HE，×400）

2.4 T2DM大鼠腎纖維化情況正常對照組大鼠腎小球和腎間質可見少量膠原；模型組腎組織膠原量較正常對照組明顯增多，腎小球和腎間質區膠原呈彌漫性分布；與模型組相比，大蒜素低、中、高劑量組大鼠腎小球和腎間質區膠原呈不同程度減少，以大蒜素高劑量組效果最為顯著。CVF計算結果：模型組大鼠腎組織CVF較正常對照組升高（P＜0.01）；與模型組相比，大蒜素低、中、高劑量組大鼠腎組織CVF降低（P＜0.01）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠腎組織纖維化情況（Masson，×400）

表3 各組大鼠腎組織CVF值（±s）%

表3 各組大鼠腎組織CVF值（±s）%

注：與正常對照組比較，**表示P＜0.01；與模型組比較，△△表示P＜0.01

CVF 11.98±1.86 67.25±7.48**49.73±6.31△△38.04±4.97△△16.85±2.91△△組別正常對照組模型組大蒜素低劑量組大蒜素中劑量組大蒜素高劑量組鼠數10 10 10 10 10

2.5 T2DM大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表達模型組大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表達較正常對照組顯著上調（P＜0.01）；與模型組相比，大蒜素中、高劑量組TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表達顯著下調（P＜0.01）。見表4、圖3。

圖3 各組大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表達（IHC，×400）

表4 各組大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、ColI、Col Ⅲ蛋白表達（±s）

注：與正常對照組比較，**表示P＜0.01；與模型組比較，△△表示P＜0.01

組別正常對照組模型組大蒜素低劑量組大蒜素中劑量組大蒜素高劑量組Col Ⅲ0.038±0.007 0.152±0.023**0.146±0.022 0.124±0.017△△0.101±0.015△△鼠數10 10 10 10 10 TGF-β1 0.049±0.006 0.175±0.027**0.151±0.024 0.127±0.018△△0.086±0.013△△p-Smad2 0.073±0.010 0.182±0.029**0.156±0.024 0.114±0.015△△0.080±0.011△△p-Smad3 0.055±0.007 0.127±0.021**0.118±0.019 0.101±0.014△△0.089±0.012△△Col I 0.031±0.005 0.206±0.032**0.179±0.028 0.143±0.021△△0.092±0.014△△

2.6 T2DM大鼠腎組織ColI、ColⅢ蛋白表達模型組大鼠腎組織ColI、Col Ⅲ蛋白表達較正常對照組上調（P＜0.01）；與模型組相比，大蒜素中、高劑量組ColI、Col Ⅲ蛋白表達下調（P＜0.01）。見表4、圖4。

3 討論

糖尿病是一種具有高發病率的慢性代謝性疾病，DN約占糖尿病患者的30%～50%，DN發病隱匿，多數患者確診時已處于終末期腎病［12-13］。DN早期即可見腎小球和腎間質進行性纖維化，是導致腎功能持續惡化的關鍵因素［14］。因此，抑制腎組織纖維化是延緩DN疾病進展的關鍵。

T2DM屬中醫“消渴”范疇，其病機為氣陰兩虛、脾腎陽虛、瘀血濁毒內停［15-16］。大蒜素是大蒜球莖的活性成分，目前臨床上主要用于深部真菌和細菌感染的治療，藥理學研究發現大蒜素具有良好的抗纖維化作用［5-7］。本研究發現，大蒜素治療4周能夠明顯降低T2DM大鼠空腹血糖水平、提高體質量，改善腎功能指標（降低24h UP水平和血清BUN、SCr含量），并改善T2DM大鼠腎組織病變和腎組織纖維化。

TGF-β1是一種纖維化誘導因子，能夠通過調控細胞外基質相關基因轉錄表達而加速組織纖維化。Smads為TGF-β1下游靶分子，被TGF-β1誘導磷酸化（p-Smads）后能夠誘導細胞外基質生成增多。黃秀等［17］研究發現TGF-β1/Smads信號通路在腎纖維化過程中發揮著關鍵作用。本研究發現，大蒜素治療4周能夠顯著下調DM大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和Col I、Col Ⅲ蛋白表達。

綜上所述，大蒜素對T2DM大鼠腎組織纖維化具有抑制作用，其機制可能與調控TGF-β/Smad信號通路，進而抑制細胞外基質生成有關。