基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法探討健脾利濕養(yǎng)肝方治療慢加急性肝衰竭的作用機(jī)制

黃 琦,李 靜,馬文峰,韓志毅,孫嘉玲,張 衛(wèi),孫新鋒,陳劍平,周小舟,

[1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510006;2. 深圳市中醫(yī)院國家臨床肝病(中醫(yī))重點(diǎn)專科,廣東 深圳 518033;3. 澳門科技大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,澳門 999078;4. 深圳市中醫(yī)院中藥制劑研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 深圳 518033]

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)是繼發(fā)于慢性肝病的一個危急重癥綜合征候群,臨床癥狀復(fù)雜多變,并且尚無特效的治療方法。在慢性肝病中的發(fā)病率常大于10%,且死亡率可達(dá)50%以上[1]。西醫(yī)對ACLF的治療主要是處理誘發(fā)事件、減少炎癥反應(yīng)及防止器官衰竭等對癥支持治療。中醫(yī)沒有ACLF病名,根據(jù)其復(fù)雜多樣的癥狀,可將其納入“急黃”、“瘟黃”、“鼓脹”、“血證”、“肝厥”等重癥范疇。現(xiàn)代中醫(yī)總結(jié)本病辨證定位多以肝、脾為主,辨證定性則多以濕熱、氣虛為主,病理變化過程多呈現(xiàn)為“濕熱-熱毒-瘀虛”[2]。病久傳脾,而熱邪亦可傷陰血,且“見肝之病,知肝傳脾”,故中醫(yī)治療以調(diào)和氣血為大法,氣血運(yùn)行暢達(dá),則病情向好。

前期本課題通過對全國不同區(qū)域18家單位962例ACLF及慢性肝衰竭進(jìn)行多中心大樣本臨床觀察發(fā)現(xiàn)：臨床聯(lián)合中藥復(fù)方治療可有效降低血清內(nèi)毒素水平、減少并發(fā)癥并降低病死率[3]。在此基礎(chǔ)上,篩選出有效中藥方劑健脾利濕養(yǎng)肝方(后簡稱養(yǎng)肝方),其由黃芪、綿茵陳、山藥、山茱萸、草果、田基黃、焦山楂、砂仁、香附組成,具有健脾益氣、清利濕熱的功效[4]。

近年來中醫(yī)在理論、臨床、中藥三方面的分子生物研究已經(jīng)起步,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)可以從中醫(yī)理論上拓展生物信息學(xué)的空間,在中藥臨床療效基礎(chǔ)上說明分子機(jī)制,并深化對中藥的基因研究[5]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法,構(gòu)建養(yǎng)肝方治療ACLF的中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,并對其潛在靶點(diǎn)和分子機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)地研究。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法

1.1.1養(yǎng)肝方活性成分和靶點(diǎn)搜集 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,https：//tcmsp-e.com/)、BATMAN-TCM生物信息學(xué)分析平臺(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)及SwissTargetPrediction(http：//swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫查找獲得養(yǎng)肝方中黃芪、綿茵陳、山藥、山茱萸、草果、田基黃、焦山楂、砂仁、香附的所有有效成分及作用靶點(diǎn),選取人源靶點(diǎn),合并刪除重復(fù)靶點(diǎn)。

1.1.2ACLF疾病靶點(diǎn)搜集 使用Acute-on-chronic liver failure及Acute on chronic liver failure作為關(guān)鍵詞,搜索DrugBank(https：//www.drugbank.ca/),人類疾病相關(guān)的基因與突變位點(diǎn)信息的數(shù)據(jù)庫(Disgenet,http：//www.disgenet.org/home/),基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards,https：//www.genecards.org/),治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(TTD,http：//db.idrblab.net/ttd),人類孟德爾遺傳病數(shù)據(jù)庫(OMIM,https：//www.omim.org/),獲得ACLF疾病相關(guān)靶點(diǎn),合并所有靶點(diǎn)并去除重復(fù)靶點(diǎn)。

1.1.3養(yǎng)肝方與ACLF相關(guān)靶點(diǎn)交集的構(gòu)建 養(yǎng)肝方的作用靶點(diǎn)與ACLF疾病靶點(diǎn)使用韋恩圖取交集,獲得養(yǎng)肝方治療ACLF作用靶點(diǎn)。

1.1.4構(gòu)建PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖及篩選關(guān)鍵作用靶點(diǎn) 將養(yǎng)肝方治療ACLF作用靶點(diǎn)上傳到STRING數(shù)據(jù)庫 (http：//string-db.org)獲取 PPI信息。置信度得分為 0.7。以 TSV格式導(dǎo)出后由Cytoscape可視化,構(gòu)建中藥-靶點(diǎn)-疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。使用Cytoscape中Network analyzer和CytoNCA計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)及閾值,包括度中心性(degree)、緊密中心性(closeness centrality)、介數(shù)中心性(betweenness centrality)。

1.1.5養(yǎng)肝方治療ACLF作用靶點(diǎn)的富集分析 使用注釋及可視化整合分析工具DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行養(yǎng)肝方治療ACLF作用靶點(diǎn)的富集分析,包括基因本體(Gene Ontology,GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析。依托R語言繪制出GO功能和KEGG通路富集氣泡圖、柱狀圖。

1.1.6關(guān)鍵作用靶點(diǎn)和主要活性成分的分子對接 關(guān)鍵作用靶點(diǎn)蛋白的3D蛋白結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB(http：//www.rcsb.org/)中獲得。對養(yǎng)肝方有效成分進(jìn)行兩兩交集求重復(fù)性進(jìn)行排序篩選,后以生物利用度OB值≥30%,類藥性DL≥0.18為篩選條件,分選出養(yǎng)肝方中的主要活性成分,并通過Pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫下載其3D結(jié)構(gòu)圖。使用AutoDock對蛋白質(zhì)受體文件和配體文件進(jìn)行處理,后再進(jìn)行主要活性成分與關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的分子對接。使用PyMOL軟件將主要活性成分與關(guān)鍵作用靶蛋白之間的相互作用可視化,并顯示為 2D圖。

1.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑 雄性C57BL/6J小鼠,6-8周齡,購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。養(yǎng)肝方(黃芪20 g、綿茵陳30 g、山藥15 g、山茱萸10 g、草果10 g、田基黃20 g、焦山楂15 g、砂仁5 g、香附10 g)中藥材購自深圳市中醫(yī)院。SRC(GB111035)、EGFR(GB111504)購買于Servicebio生物技術(shù)公司,VEGFA(bs-1313R)、HRAS(bs-1071R)購買于Bioss公司,STAT3(ab68153)購買于Abcam公司。LPS(L4391)、D-galactosamine(G1639)購買于Sigma公司。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中科產(chǎn)業(yè)控股(深圳)有限公司動物福利倫理委員會批準(zhǔn),批準(zhǔn)號：20220059。

1.2.2動物模型構(gòu)建及給藥 建立肝纖維化小鼠模型,將小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和養(yǎng)肝方組,每組4只。第1～8周,對照組腹腔注射生理鹽水,每周2次;模型組及養(yǎng)肝方組腹腔注射四氯化碳溶液(0.2 mL),每周2次。第9～12周,對照組每周3次腹腔注射生理鹽水,模型組每周3次腹腔注射四氯化碳,每天灌胃生理鹽水0.6 mL;養(yǎng)肝方組每周3次腹腔注射四氯化碳,每天灌胃養(yǎng)肝方水煎劑0.6 mL。在上述模型構(gòu)建成功后,小鼠腹腔注射LPS(10 μg·kg-1)和D-Gal(500 mg·kg-1)的PBS溶液(200 mL),24 h后通過腹腔注射麻醉劑(如三溴乙醇類)對小鼠進(jìn)行深度麻醉,麻醉穩(wěn)定后對收集小鼠的肝臟進(jìn)行檢測。

1.2.3HE染色 取出肝臟,多聚甲醛固定組織48 h時,梯度乙醇及二甲苯脫水透明后石蠟包埋。切片后用蘇木精-伊紅進(jìn)行染色及封片。

1.2.4免疫組化測定組織內(nèi)蛋白的表達(dá) 將石蠟包埋組織切片后依次放入二甲苯及梯度乙醇脫蠟,后放入檸檬酸鈉抗原修復(fù)液沸水煮20 min以組織修復(fù),將抗原修復(fù)后切片置于內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑H2O2并滴加一抗過夜孵育。次日充分洗滌后,切片滴加辣根酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物反應(yīng)及適量DAB顯色劑,5～20 min終止顯色并封片。

2 結(jié)果

2.1 養(yǎng)肝方治療ACLF作用靶點(diǎn)的獲得通過TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺及BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫,查找得到養(yǎng)肝方的所有化學(xué)成分。其中養(yǎng)肝方有536個化學(xué)成分,821個基因靶點(diǎn)。利用疾病數(shù)據(jù)庫,得到1 580個ACLF靶點(diǎn)。通過Venn圖取交集,共得到244個交集靶點(diǎn),即養(yǎng)肝方治療ACLF作用靶點(diǎn),見Fig 1。

Fig 1 Venn diagram of drug-disease target intersection

2.2 養(yǎng)肝方治療ACLF靶點(diǎn)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點(diǎn)蛋白的篩選養(yǎng)肝方治療ACLF靶點(diǎn)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖見Fig 2,共237個點(diǎn),2 294條邊。選取PPI網(wǎng)絡(luò)圖中,度中心性、緊密中心性及介數(shù)中心性均較大的7個蛋白為核心蛋白即AKT1、SRC、VEGFA、STAT3、EGFR、MAPK3、HRAS。養(yǎng)肝方與ACLF交集基因中核心靶點(diǎn)基因的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)見Fig 3。

Fig 2 PPI Network diagram of potential target

Fig 3 Core gene screening

2.3 養(yǎng)肝方治療ACLF作用靶點(diǎn)的GO分析結(jié)果GO分析包括細(xì)胞組分、分子功能及生物過程的分析,見Fig 4。養(yǎng)肝方治療ACLF的生物過程主要包括T細(xì)胞共刺激、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA模板正轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的正調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)節(jié)等。細(xì)胞組分主要涉及轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、突觸后特化、突觸后密度、質(zhì)膜、磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物。分子功能主要集中在跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、支架蛋白結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄、蛋白酪氨酸激酶活性等。

Fig 4 Visual analysis diagram of biological process, cell composition, molecular function

2.4 養(yǎng)肝方治療ACLF作用靶點(diǎn)的KEGG分析養(yǎng)肝方治療ACLF作用靶點(diǎn)的KEGG分析結(jié)果見Fig 5。富集顯著性較高的通路主要包括：癌癥中PD-1和PD-L1檢查點(diǎn)信號抑制通路、JAK-STAT信號通路、趨化因子信號通路、C型凝集素受體信號通路等。表明養(yǎng)肝方主要通過以上通路來治療ACLF。

Fig 5 Visual analysis diagram of KEGG

2.5 養(yǎng)肝方主要活性成分篩選對養(yǎng)肝方536個有效成分的重復(fù)性進(jìn)行排序篩選,再以O(shè)B≥30%,類藥性DL≥0.18為篩選條件過濾,見Tab 1。其中槲皮素重復(fù)性為6,且OB=46.43%,DL=0.28,即選擇槲皮素作為后續(xù)分子對接的靶點(diǎn)蛋白。

Tab 1 The main active ingredients of JPLSYGF

2.6 槲皮素與核心靶點(diǎn)蛋白分子對接將槲皮素與7個核心靶點(diǎn)蛋白AKT1、SRC、VEGFA、STAT3、EGFR、MAPK3、HRAS進(jìn)行分子對接,結(jié)合能數(shù)據(jù)依次為-5.9、-8.2、-7.2、-8.2、-8.6、-6.8、-8.8 kJ·mol-1。一般認(rèn)為,結(jié)合能-5.0 kJ·mol-1,表明這種成分與核心靶點(diǎn)蛋白結(jié)合性較好,結(jié)合能<-7.0 kJ·mol-1,表明此種物質(zhì)與核心靶點(diǎn)蛋白有很強(qiáng)結(jié)合活性。除槲皮素與AKT1、MAPK3的結(jié)合能為-5.9、-6.8 kJ·mol-1之外,其余的結(jié)合能均<-7.0 kJ·mol-1,說明槲皮素與核心靶點(diǎn)蛋白結(jié)合良好。槲皮素與和核心靶點(diǎn)蛋白分子對接示意圖見Fig 6。

Fig 6 Molecular docking diagram

2.7 動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證隨后我們研究了養(yǎng)肝方是否通過以上核心靶點(diǎn)對ACLF發(fā)揮治療作用。收集小鼠血清進(jìn)行生化指標(biāo)檢驗(yàn)。Fig 7A、B可見與正常組比較,模型組與養(yǎng)肝方組小鼠血清ALT和AST均升高;且與模型組比較,養(yǎng)肝方組ALT及AST均降低,這說明養(yǎng)肝方對ACLF的肝損傷有保護(hù)作用,具有一定的生物安全性。Fig 7C HE染色結(jié)果可見,正常組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常且連接緊密,結(jié)構(gòu)完整,無炎癥細(xì)胞細(xì)潤;模型組小鼠的肝細(xì)胞腫脹,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,炎癥及Kupffer細(xì)胞浸潤(黑色箭頭處);養(yǎng)肝方組肝損傷細(xì)胞減少,細(xì)胞形態(tài)較為完整,結(jié)構(gòu)基本正常,炎癥浸潤程度也明顯降低(黑色箭頭處)。隨后我們對分子對接的結(jié)合能均<-7.0 kJ·mol-1的靶點(diǎn)SRC、VEGFA、STAT3、EGFR、HRAS進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn),Fig 7D可見與模型組相比,養(yǎng)肝方均可下調(diào)HRAS、EGFR、STAT3、SRC、VEGFA蛋白的表達(dá)。

Fig 7 In vivo test

3 討論

ACLF是一種具有挑戰(zhàn)性的疾病,其特征在于不同的臨床癥狀、疾病進(jìn)展快和高短期死亡率。ACLF通常由細(xì)菌感染(35%)、消化道出血(22%)和酒精(19%)引發(fā),病理生理學(xué)特征為全身性炎癥反應(yīng)并伴有矛盾的免疫缺陷[6]。這種疾病具有明確的發(fā)病機(jī)制和流行病學(xué)負(fù)擔(dān),因此臨床上需要開發(fā)特定和有效的療法來治療這種疾病。本研究在前期臨床研究中篩選出有效中藥方劑養(yǎng)肝方,利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)策略,系統(tǒng)地研究養(yǎng)肝方治療ACLF作用的潛在作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制,并進(jìn)行動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

GO富集分析顯示,生物過程主要包括T細(xì)胞共刺激、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶II對轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等。細(xì)胞組分主要涉及轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、突觸后特化、突觸后密度等。分子功能主要集中在跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、支架蛋白結(jié)合等。ACLF患者常表現(xiàn)出免疫功能障礙,T淋巴細(xì)胞功能障礙是ACLF免疫抑制的重要機(jī)制[7]。研究發(fā)現(xiàn),ACLF中的T淋巴細(xì)胞功能障礙多表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞的凋亡增加、增殖能力減弱及反應(yīng)性降低[8]。KEGG分析顯示,富集顯著性較高的通路主要包括癌癥中PD-1和PD-L1檢查點(diǎn)信號抑制通路、JAK-STAT信號通路、趨化因子信號通路、C型凝集素受體信號通路等。PD-1主要在活化的CD8+T淋巴細(xì)胞中表達(dá),其配體是PD-L1/PD-L2,PD-L1/PD-L2共刺激信號通路在T淋巴細(xì)胞活化、增殖及分泌細(xì)胞因子中起重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用[9]。Li等[10]發(fā)現(xiàn)SOCS3主要通過JAK/STAT3信號通路執(zhí)行其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的負(fù)調(diào)節(jié)作用,且其表達(dá)水平在HBV-ACLF患者的肝臟組織和PBMC中均顯著升高,并與肝損傷程度呈正相關(guān)。總結(jié)以上研究提示,PD-1/PD-L1信號通路、JAK/STAT信號通路可能在ACLF的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。

本研究選取養(yǎng)肝方治療ACLF的7個核心靶點(diǎn)蛋白中結(jié)合能前5的HRAS、EGFR、STAT3、SRC、VEGFA蛋白進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。HRAS參與RAS/MAPK途徑,負(fù)責(zé)控制基因轉(zhuǎn)錄活動和細(xì)胞循環(huán)周期,與細(xì)胞增殖有關(guān)[11]。HRAS蛋白處于持續(xù)激活狀態(tài)時可導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控[12]。可見模型組HRAS高度活躍,同時養(yǎng)肝方可以下調(diào)HRAS表達(dá)并可維持正常細(xì)胞周期。RAS/MAPK途徑也是EGFR下游通路之一,EGFR的過表達(dá)或發(fā)生突變時,也會導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[13]。本實(shí)驗(yàn)中模型組可見EGFR高度表達(dá),相反養(yǎng)肝方逆轉(zhuǎn)了這一趨勢。SRC作為一種人類普遍表達(dá)的蛋白酪氨酸激酶,其異常激活可促進(jìn)內(nèi)皮-間充質(zhì)等過程,將正常細(xì)胞轉(zhuǎn)為癌細(xì)胞[14]。Du等[15]通過抑制SRC的激活,可阻止肝星狀細(xì)胞的增殖和遷移,以延緩肝纖維化進(jìn)程。同樣的,養(yǎng)肝方可以抑制SRC的激活,這說明養(yǎng)肝方也可延緩慢性肝病肝臟的纖維化進(jìn)程。Sole等[16]通過對比研究55名肝硬化患者發(fā)現(xiàn)ACLF患者血漿細(xì)胞因子中的VEGFA與ACLF關(guān)系最顯著。肝組織炎癥及損傷后模型組VEGFA分泌增加,血管通透性增加,炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子浸潤增加,放大了炎癥信號,導(dǎo)致血管滲透、水腫及炎癥[17]。養(yǎng)肝方可降低體內(nèi)炎癥反應(yīng),下調(diào)VEGFA表達(dá)。促進(jìn)肝細(xì)胞再生是ACLF的重要方面,而STAT3與肝臟促再生途徑有關(guān)。Xiang等[18]研究發(fā)現(xiàn),IL-6/STAT3通路的破壞會過度激活I(lǐng)FN-γ/STAT1通路導(dǎo)致肝再生能力減弱,STAT3途徑的下調(diào)有利于ACLF的恢復(fù)。這與HE的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,同樣在本研究中ACLF小鼠表現(xiàn)出顯著激活的STAT3信號傳導(dǎo),養(yǎng)肝方下調(diào)了STAT3的表達(dá)。

綜上所述,養(yǎng)肝方具有健脾益氣、清利濕熱的功效,其可以作用HRAS、EGFR、STAT3、SRC、VEGFA等核心靶點(diǎn),通過控制細(xì)胞增殖、維持細(xì)胞周期、抑制內(nèi)皮-間充質(zhì)及炎癥反應(yīng),以達(dá)到治療ACLF的作用。