桃紅四物湯對大腦中動脈閉塞大鼠lncRNA表達(dá)的影響

張麗娟,費長義,余 超,薛蘇君,李雨朦,李靜靜,潘凌宇,段賢春,3,彭代銀

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,安徽 合肥 230031;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,3.中藥復(fù)方安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012)

缺血性中風(fēng)是一種突發(fā)的腦血液循環(huán)障礙疾病。缺血性中風(fēng)后,信使RNA表達(dá)譜在血液或腦中發(fā)生變化,microRNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和環(huán)狀RNA(circRNA)參與RNA介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[1],LncRNA為轉(zhuǎn)錄本長度大于200個核苷酸的長鏈非編碼RNA,已被證明是生長和疾病的關(guān)鍵基因調(diào)節(jié)因子[2]。LncRNA也可以與miRNA競爭性結(jié)合,被稱為“競爭性內(nèi)源性RNA”(ceRNA)。研究表明,顯著差異表達(dá)的lncRNA(DEL)與缺血性中風(fēng)的病理過程密切相關(guān)[3]。許多l(xiāng)ncRNA已經(jīng)通過平行測序技術(shù)進(jìn)行了鑒定。然而,功能性RNA分子和RNA介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在中風(fēng)中的具體作用機制尚不清楚。因此,通過研究lncRNAs與mRNAs之間的相互作用,我們可以更深入地了解缺血性中風(fēng)的病理生理過程。桃紅四物湯(Tao Hong Si Wu decoction,THSWD)是一種傳統(tǒng)中藥(TCM)制劑,包含桃仁、當(dāng)歸、紅花、地黃、芍藥和川芎六味草藥,可有效治療心肌損傷和產(chǎn)后血瘀等疾病[4]。課題組前期使用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF-MS)來鑒定THSWD的成分,從這項工作中,我們確定了5種主要活性成分：沒食子酸、原兒茶酸、羥基紅花黃A、苦杏仁苷和芍藥苷[5]。THSWD治療大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)的機制在近幾年已經(jīng)有了許多研究成果。例如,THSWD被證明可以通過調(diào)節(jié)腦細(xì)胞壞死和炎癥來治療腦缺血[6]。然而,THSWD治療后MCAO的lncRNA失調(diào)很少受到關(guān)注,我們旨在利用RNA測序揭示THSWD治療MCAO大鼠相關(guān)的lncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級Sprague-Dawley大鼠(200±20 g,7周)購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,SCXK(安徽)2017-0004,所有動物實驗均經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)(許可證號：LLSC20160336)。室溫25 ℃左右,60%±5%相對濕度,自然光暗周期和自由飲水條件下飼養(yǎng)1周,待其適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行實驗。

1.2 主要試劑與儀器mirVanaTM miRNA Isolation kit(美國 Thermo Fisher Scientific,貨號：AM1561);TRIzol提取試劑(美國 Thermo Fisher Scientific,貨號：15596026);RNeasy試劑盒(德國 Qiagen,貨號：74104);RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒(美國 Thermo Fisher Scientific,貨號：K1622)。

生物分析儀(美國 Agilent Technologies Inc);微量紫外分光光度計、熒光計、熒光定量PCR儀(美國 Thermo Fisher Scientific);Illumina Hiseq 2500(美國Illumina)。

1.3 主要數(shù)據(jù)庫與軟件Seqtk(https：//github.com/lh3/seqtk);Venny(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/);Cytoscape(https：//cytoscape.org/);GO(http：//geneontology.org/);KEGG(https：//www.genome.jp/kegg);Genome Browser(https：//genome.ucsc.edu/);PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/);PDB數(shù)據(jù)庫(https：//www.rcsb.org/);AutoDockTools 1.5.7;Pymol 2.4。

1.4 方法

1.4.1動物實驗與分組 將大鼠隨機分為3組,每組10只：正常組,MCAO組和THSWD給藥組。經(jīng)過一周的適應(yīng)性飼養(yǎng),建立MCAO模型[7]。在大鼠MCAO造模24 h后,使用ZeaLonga方法對神經(jīng)功能進(jìn)行評分,以確定造模是否成功。得分為1-3的大鼠被認(rèn)為是成功的模型,并被納入實驗組進(jìn)行后續(xù)實驗,模型組和對照組在沒有任何治療的情況下正常飼養(yǎng)。THSWD組灌胃THSWD煎劑,一天一次。灌胃7 d后,老鼠被安樂死。收集左半球并立即在液氮中冷凍。

1.4.2THSWD制備 THSWD購自安慶華仕中藥飲片有限公司(桃仁(批號 17033101)、紅花(批號 17041401)、熟地黃(批號 17042501)、白芍(批號 17050301)、當(dāng)歸(批號 16070501)和川芎(批號 17061601)),根據(jù)所需的THSWD比例稱量所需的藥材,在10倍量水中浸泡0.5 h后煮沸2 h。然后,收集濾液,殘余物用8倍量的水煮沸2 h。將兩種濾液混合并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1.8 kg·L-1。

1.4.3RNA測序 使用TRIzol試劑從大腦梗死區(qū)域提取總RNA。然后,使用RNeasy試劑盒進(jìn)行RNA純化和柱上DNase消化。分光光度計和生物分析儀進(jìn)行序列質(zhì)量分析,VAHTS Total RNA-seq (H/M/R) Library Prep Kit for Illumina試劑盒構(gòu)建文庫。純化的互補cDNA文庫通過熒光計和生物分析儀分析,然后根據(jù)制造商的說明,在 HiSeq 2500 平臺上進(jìn)行簇生成和測序。由奧吉生物(中國上海)進(jìn)行文庫構(gòu)建和RNA測序,并使用計算機進(jìn)行分析數(shù)據(jù)。

1.4.4DEL的注釋和篩選 原始數(shù)據(jù)由FastQC v0.11.3鑒定,并由seqtk進(jìn)行修剪。使用Hisat2 v2.0.4將修剪后的讀數(shù)映射到大鼠基因組(Rn6)。應(yīng)用Stringtie(version：1.3.0)對Hisat2比對后每個基因的Fragments數(shù)進(jìn)行計數(shù),然后用TMM(trimmed mean of M values)法進(jìn)行歸一化,最后利用perl腳本計算出每個基因的FPKM值。根據(jù)lncRNA在基因組上與附近mRNA的位置關(guān)系,對lncRNA進(jìn)行分類。應(yīng)用Stringtie(version：1.3.0)對預(yù)測的novel lncRNA和NONCODE數(shù)據(jù)庫,以及Ensembl數(shù)據(jù)庫中的已知lncRNA進(jìn)行表達(dá)定量。MCAO組和對照組之間差異表達(dá)的lncRNA被命名為mcDEL,由edgeR篩選(|log2(FC)|>1,P<0.05)。接下來,Venny用于識別上調(diào)mcDEL和上調(diào)mtDEL的交集DEL(上調(diào)iDEL,即THWSD逆轉(zhuǎn)MCAO異常上調(diào)lncRNA),下調(diào)mcDEL和下調(diào)mtDEL的交集DEL(下調(diào)iDEL,即THWSD逆轉(zhuǎn)MCAO異常下調(diào)lncRNA)。

1.4.5lncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了更進(jìn)一步的了解lncRNA的功能,使用皮爾遜相關(guān)性計算了lncRNA和mRNA之間的相關(guān)性(|r|>0.95和P<0.000 1)。LncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)由Cytoscape構(gòu)建。在這個共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中,每個lncRNA或mRNA對應(yīng)一個節(jié)點。通過clusterProfiler對lncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行注釋,以識別與DEL相關(guān)的信號通路。Cytoscape中的MCODE插件用于識別lncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)模塊。隨后,在Cytoscape中可視化得到兩個典型模塊的子網(wǎng)絡(luò)。此外,clusterProfiler還使用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫分析了兩個典型模塊富集的生物功能和信號通路。

1.4.6iDEL的順反式調(diào)控分析 LncRNA可以通過順式調(diào)節(jié)附近的蛋白質(zhì)編碼基因和反式調(diào)節(jié)遠(yuǎn)端蛋白質(zhì)編碼基因來調(diào)節(jié)其靶基因。因此,基于順式或反式作用算法預(yù)測lncRNA的潛在靶標(biāo)。首先,使用Genome Browser來鑒定lncRNA的順式調(diào)控網(wǎng)絡(luò),以lncRNA距離<10 kb的gene作為cis作用的靶基因。其次,分析lncRNA-mRNA的序列互補性和雙鏈能量,預(yù)測lncRNA的潛在反式作用靶基因。用BLASTN和RNAplex預(yù)測潛在的反式作用靶mRNA,相似性>95%、e<1e-50和RNAplex分析結(jié)合能<30。

1.4.7RT-qPCR 根據(jù)制造商(中國 賽默飛世爾科技公司)的說明,使用RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒對來自每個樣品的等量總RNA進(jìn)行反向轉(zhuǎn)錄以生成cDNA。使用實時熒光定量PCR系統(tǒng)驗證NONRATT024616,NONRATT030683,NONRATT004058,NONRATT010334,NONRATT003292,NONRATT000 003,C1qb和Hemox的基因表達(dá),使用2-ΔΔCT法計算基因表達(dá)量。甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)mRNA用作內(nèi)部對照。RT-qPCR在含有cDNA(2.0 μL)、qPCR SYBR綠色預(yù)混液(10 μL)、每種引物0.4 μL和ddH2O(7.2 μL)的20 μL反應(yīng)混合物中進(jìn)行。PCR反應(yīng)程序為：酶在50 ℃下活化2 min,在95 ℃下初始變性10 min,然后在95 ℃下進(jìn)行40次循環(huán),持續(xù)15 s,在60 ℃下持續(xù)1 min。從3個獨立樣品中測定相對基因表達(dá),每個樣品一式3份測定。本實驗中使用的所有引物均列于Tab 1中。

Tab 1 Primer sequences

1.4.8分子對接實驗 活性化合物的2D結(jié)構(gòu)從Pubchem官方網(wǎng)站下載。通過Chem3D 20.0軟件將二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu),并對其進(jìn)行優(yōu)化。在PDB數(shù)據(jù)庫中下載靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)。將靶蛋白和化合物的三維結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.7軟件,并對分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理。然后選擇AutoDockTool vina進(jìn)行分子對接,并分析其結(jié)合活性。Pymol 2.4軟件用于可視化。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA測序數(shù)據(jù)分析我們分析了在對照組、MCAO組和THSWD組中表達(dá)的lncRNA的特征,并且比較了這三組之間的差異和相似之處。從9個樣本中鑒定了24 637個lncRNA,其中22 772個相互lncRNA(Fig 1A)在三組中均有表達(dá)。接下來,我們分析了篩選的lncRNA在大鼠染色體上的分布,發(fā)現(xiàn)所有染色體均有表達(dá)。其中,lncRNA在九條染色體(chr1-8和chr10)表達(dá)>1 000個,其中表達(dá)lncRNA最多的是chr1(Fig 1B)。根據(jù)lncRNA在基因組上相對于蛋白編碼基因的位置,lncRNA可分為五種類型,我們使用這些類別來分析已篩選的lncRNA。大多數(shù)是從蛋白質(zhì)編碼外顯子轉(zhuǎn)錄而來的,而另一些從內(nèi)含子和基因間區(qū)域轉(zhuǎn)錄(Fig 1C)。

Fig 1 Venn diagram(A),chromosome distribution(B) and class type(C) of lncRNAs identified in control,MCAO and THSWD groups

Fig 2 THSWD-reversed lncRNAs with MCAO

2.2 THSWD對lncRNA表達(dá)的影響314個下調(diào)mcDEL和332下調(diào)mtRNA進(jìn)行交集分析獲得116個下調(diào)iDEL(THSWD逆轉(zhuǎn)MCAO下調(diào)lncRNA)(Fig 2)。此外,從563個上調(diào)mcDEL和339個上調(diào)mtRNA中篩選到了186個上調(diào)iDEL(Fig 2)。因此,THSWD可以逆轉(zhuǎn)MCAO中302個失調(diào)的lncRNA(116個下調(diào)iDEL和186個上調(diào)iDEL)。染色體分布分析表明,所有染色體都有下調(diào)的iDEL、上調(diào)iDEL和交集iDEL。我們確定了5條染色體(chr1、chr2、chr5、chr7、chr10),包含的iDEL>20個,其中chr1含有最多的iDEL(Fig 3A)。類別分析表明,大多數(shù)iDEL是從蛋白質(zhì)編碼外顯子轉(zhuǎn)錄而來的,少數(shù)iDEL則來自內(nèi)含子和基因間區(qū)域(Fig 3B)。這些結(jié)果與三組表達(dá)的lncRNA(2.1部分)特征相似。

Fig 3 Features of THSWD-reversed lncRNAsA： Chromosome distribution, B： Class type.

2.3 lncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和模塊分析為了進(jìn)一步了解在MCAO中被THSWD調(diào)節(jié)的iDEL,構(gòu)建了lncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。使用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析。通過Cytoscape,基于相關(guān)系數(shù)(|r|>0.95)和P值(P<0.001)構(gòu)建了lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)度值,前5名lncRNA分別為MSTRG.21354.5、NONRATT016046.2、NONRATT 016429.2、NONRATT003285.2和NONRATT004 058.2。根據(jù)度值,前6名的編碼蛋白mRNA分別為RGD1311343、LOC684828、Cnn2、Hist3h3、A3galt2和Cd93。GO分析和KEGG分析展示了前30個富集結(jié)果(Fig 4A,4B)。GO分析表明,這些DEL與“有絲分裂細(xì)胞周期”、“有絲分裂”、“染色體分離”、“細(xì)胞分裂”和“細(xì)胞周期”有關(guān)。KEGG分析表明,涉及的信號通路是“ECM-受體相互作用”、“細(xì)胞周期”、“補體和凝血級聯(lián)”等。通過MCODE插件分析,確定了10個模塊。前3個模塊按降序排列,MCODE得分≥1.5,節(jié)點≥10的分別被視為模塊1,模塊2和模塊3。隨后,選擇包含大于10個蛋白質(zhì)編碼基因的模塊1和模塊3進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。分別對模塊1(Fig 5B,5C)和模塊3(Fig 6B,6C)進(jìn)行了生物功能富集分析和信號通路富集分析。屬于這些模塊的大多數(shù)iDEL在模塊1和模塊3的MCAO組中上調(diào)。在模塊1中,有12個lncRNA(NONRATT030953.2,NONRATT030261.2,NONRATT026655.2,NONRATT023599.2,NONRATT017195.2,NONRATT 015182.2,NONRATT009960.2,NONRATT007019.2,NONRATT005984.2,NONRATT003292.2和NONRATT000003.2)。這些lncRNA參與“造血細(xì)胞譜系”、“百日咳”、“ECM-受體相互作用”、“系統(tǒng)性紅斑狼瘡”、“補體和凝血級聯(lián)”(Fig 5)。我們還在模塊3中確定了NONRATT030262.2,NONRATT 008267.2和NONRATT010334.2,信號通路分析顯示這三種lncRNA與“ECM-受體相互作用”、“局灶黏附”、“補體和凝血級聯(lián)”有關(guān)(Fig 6)。

Fig 4 Top-30 significantly enriched terms using GO database (A) and KEGG database (B) with lncRNA-mRNA network

Fig 5 Module 1 subnet (A), GO (B) and KEGG (C) of lncRNA-mRNA networkCircular nodes denote mRNAs, and Vee nodes denote lncRNAs.

Fig 6 Module 3 subnet (A), GO (B) and KEGG (C) of lncRNA-mRNA networkCircular nodes denote mRNAs, and Vee nodes denote lncRNAs.

2.4 iDEL的順反式調(diào)控基因我們在MCAO中鑒定了250個iDEL的225個順式調(diào)節(jié)基因(153個上調(diào)iDEL和97個下調(diào)iDEL),這些基因由THSWD調(diào)節(jié)。此外,這225個順式調(diào)節(jié)基因中有32個具有差異表達(dá),其中38個iDEL與這32個差異表達(dá)順式調(diào)控基因呈正相關(guān)。同時,我們發(fā)現(xiàn)3個iDEL和2個差異表達(dá)順式調(diào)節(jié)基因之間存在負(fù)相關(guān)。此外,經(jīng)BLASTN和RNAplex篩選了592個反式調(diào)控基因和20個iDEL組成的基因?qū)? 606對,其中5個反式調(diào)控基因具有差異性,我們進(jìn)一步篩選出了由6個iDEL和5個反式調(diào)控基因組成的15個基因?qū)?它們之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.5 通過qRT-PCR驗證DEL的表達(dá)為了進(jìn)一步驗證RNA測序數(shù)據(jù),選擇了8個iDEL(NONRAT T000003.2,NONRATT003292.2,NONRATT01033 4.2,NONRATT004058.2,NONRATT030683.2,NONRATT024616.2,C1qb和Hemox)進(jìn)行RT-qPCR。與正常組相比,MCAO組NONRATT000003.2、NONRATT003292.2、NONRATT010334.2、NONRATT004058.2、C1qb和Hemox的表達(dá)明顯上調(diào)(Fig 7B),而NONRATT030683.2和NONRATT0246 16.2的表達(dá)明顯下調(diào)(Fig 7A),這與RNA測序數(shù)據(jù)一致(Fig 7C)。

Fig 7 Gene expressions of six specified lncRNAs confirmed by RT-qPCR

2.6 分子對接本研究通過構(gòu)建lncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)和富集分析,獲得了關(guān)鍵mRNA靶點和關(guān)鍵通路,選擇Cnn2、A3galt2、C3ar1、Lgals3和CD93與活性化合物沒食子酸(gallic acid)和苦杏仁苷(amygdalin)進(jìn)行分子對接實驗驗證。此外,COX-2被認(rèn)為在大腦穩(wěn)態(tài)中起作用,因此我們也對該mRNA所指導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分子對接實驗。對接結(jié)合能(Tab 2)顯示,所有結(jié)合能均<-5 kcal·mol-1,表明蛋白質(zhì)與化合物之間存在良好的結(jié)合。分子對接的可視化結(jié)果如Fig 8所示。

Tab 2 Molecular docking binding energy

Fig 8 Compound target molecular docking

3 討論

許多參與缺血性中風(fēng)的lncRNA已經(jīng)通過微陣列技術(shù)或RNA測序技術(shù)闡明[8]。Huang等[9]發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1通過作用于HSP90促進(jìn)腦缺血/再灌注小鼠神經(jīng)元壞死性凋亡。

在本研究中,THSWD可以調(diào)節(jié)MCAO中302個失調(diào)的lncRNA(116個下調(diào)表達(dá)和186個上調(diào)表達(dá)),通過構(gòu)建lncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)、鑒定模塊和分析富集信號通路,我們發(fā)現(xiàn)補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)被富集(在腦缺血后被激活)。我們發(fā)現(xiàn)一些lncRNA(例如,NONRATT030262.2、NONRATT010334.2、NONRATT008267.2)可能參與THSWD治療后的補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)。一些研究表明,補體和凝血級聯(lián)的補體C3(Complement 3,C3)和補體C5(Complement 5,C5)成分可通過補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)和TLR4/NF-κB通路來加速MCAO損傷[10-11]。此外,THSWD抑制了C3ar1、C1qb、C1qc和C5ar1的表達(dá),這與我們的其他研究結(jié)果一致[12]。C3ar1、C1qb、C1qc和C5ar1蛋白在腦缺血的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[13]。因此,我們推測THSWD給藥可以通過抑制補體和凝血級聯(lián)來逆轉(zhuǎn)MCAO損傷。此外,生物信息學(xué)分析表明,3種lncRNA可能分別受Lgals3、Hjurp和Kif14調(diào)控。作為與小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相關(guān)的炎癥介質(zhì),Lgals3可能影響缺血性中風(fēng)疾病發(fā)生發(fā)展[14]。

我們對部分基因進(jìn)行了RT-qPCR實驗驗證,發(fā)現(xiàn)實驗結(jié)果與測序數(shù)據(jù)結(jié)果吻合。另外,本研究發(fā)現(xiàn),Cnn2、A3galt2、C3ar1、Lgals3、CD93和COX-2與沒食子酸和苦杏仁苷穩(wěn)定結(jié)合,這也證實了THSWD可能通過lncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)和富集分析通路對MCAO大鼠發(fā)揮治療作用。

綜上,THSWD可以影響MCAO大鼠的lncRNA表達(dá)。一些核心lncRNA可能在THSWD保護(hù)MCAO損傷過程中發(fā)揮重要作用。THSWD可能通過調(diào)節(jié)補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)以及各種信號通路參與缺血性中風(fēng)的治療。為缺血性中風(fēng)的分子機制研究提供了新的見解,但是,本研究對lncRNA在細(xì)胞中的具體機制研究還有一定的欠缺,因此,我們后續(xù)將繼續(xù)使用THSWD作為治療方法來研究lncRNA在不同細(xì)胞類型中的功能,深入研究這些與MCAO密切相關(guān)且受THSWD顯著調(diào)控的lncRNA的作用機制。