SIRT1/Nrf2/HO-1通路在七氟烷后處理改善失血性休克復蘇小鼠空間學習與記憶障礙中的作用

牛志倫,張 麗,胡 溯,吳雨潔,萬曉靜,胡憲文

(安徽醫科大學第二附屬醫院麻醉與圍術期醫學科,安徽 合肥 230601)

失血性休克嚴重危害人類生命健康。治療失血性休克臨床常用辦法是液體治療,盡快補充循環血量,但常會誘發腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷,出現組織和細胞損害[1]。研究報道,七氟烷能減輕腦I/R損傷[2]。本課題組前期研究證實[3],七氟烷后處理通過增加沉默信息調節因子1(silent information regulation 1,SIRT1)表達,緩解再灌注后小鼠海馬神經元線粒體功能損傷,改善認知水平,但其發揮作用的確切機制尚不清楚。腦再灌注損傷涉及多種因素,其中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的過量產生會引起組織多糖、蛋白質和腦脂質的氧化應激損傷,進一步造成細胞死亡和神經系統功能損害[4]。因此,本研究以氧化應激為切入點,探索七氟烷緩解腦I/R損傷的機制和路徑。

SIRT1的神經保護作用已在腦I/R中得到證實[3]。近年來,有研究發現SIRT1可以激活核因子E2相關因子2(nuclear transcription factor E2 related factor 2,Nrf2),減少線粒體氧化應激,增加ATP產生,使線粒體膜電位正常化,進而減少I/R時的氧化損傷[5-6]。亦有研究證明,Nrf2可以促進抗氧化因子血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)表達,降低缺氧/復氧時細胞凋亡率和線粒體ROS水平,發揮抗氧化作用[7-8]。基于SIRT1/Nrf2/HO-1信號通路在I/R事件中的積極作用,本研究擬觀察七氟烷后處理是否通過SIRT1/Nrf2/HO-1通路,改善失血性休克復蘇小鼠氧化應激與空間學習記憶障礙,為臨床預防I/R腦損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 8～10周齡的健康C57BL/6J小鼠,♂,由安徽醫科大學動物實驗中心提供,動物生產許可證號：SYXK(皖) 2020-0005。

1.1.2試劑 七氟烷(貨號：83291),購自AbbVie公司;SIRT1抑制劑EX527(貨號：CSN10146),購自CSNpharm公司;Nrf2抑制劑ML385(貨號：B8300),購自美國APExBIO公司;SIRT1抗體(貨號：ab110304)、HO-1抗體(貨號：ab189491),均購自Abcam公司;Nrf2抗體(貨號：AF0639)、ECL顯影液(貨號：KF8003),均購自Affinity公司;ATP試劑盒(貨號：S0026),購自碧云天生物技術有限公司;ROS、丙二醛(malonaldehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒(貨號：E004-1、A003-1、A001-3),均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3儀器 七氟烷蒸發罐(Drager公司);RSP01雙向全自動輸液泵(嘉興貝塔儀器有限公司);水迷宮實驗分析系統(深圳市瑞沃德公司);Tanon-4600SF凝膠成像儀(上海天能科技公司);Varioskan LUX多功能酶標儀(賽默飛世爾科技公司);氣體檢測儀(深圳邁瑞生物公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組與小鼠失血性休克復蘇模型的制備 將小鼠隨機分為5組：假手術組(Sham組)、失血性休克與復蘇組(HSR組)、七氟烷后處理組(Sevo組)、Sevo+EX527組、Sevo+ML385組,每組16只。小鼠麻醉前禁食12 h,自由飲水。腹腔注射1%戊巴比妥(50 mL·kg-1)麻醉,保持自主呼吸,仰臥位固定。將PE10管置入小鼠右頸總動脈和頸靜脈,完成后將300 U·kg-1的肝素輸入小鼠靜脈觀察10 min,然后將連接導管的1 mL注射器裝入注射泵,使用注射泵從小鼠動脈持續抽血30 min,總體積是小鼠40%總血容量。失血1 h后,將血液經右頸靜脈于30 min內重新注射入小鼠體內,完成失血性休克和復蘇術。Sham組僅在動靜脈中置入PE10管,不抽血。Sevo組先進行抽血,回輸血液時吸入由95% O2、5% CO2帶動的七氟烷,七氟烷呼氣末濃度為2.4%。Sham組和HSR組在同樣節點吸入95% O2、5% CO2混合氣30 min。Sevo+EX527組于置入導管前30 min由腹腔注射SIRT1抑制劑EX527(10 mg·kg-1)。Sevo+ML385組于置管前30 min由腹腔注射Nrf2抑制劑ML385(30 mg·kg-1),其余操作同Sevo組。

1.2.2小鼠空間與學習記憶能力測定 各組剩余小鼠于術后4～10 d實施水迷宮測試。小鼠每日進行4次練習,使小鼠朝向水池壁,依次選取Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限送進水池,統計1 min內到達平臺的時間為逃避潛伏期。如小鼠沒能到達平臺,在人為幫助下游向平臺并等候10 s,此次測試成績為60 s。兩次訓練相隔20 min,當天潛伏期為4次測試的平均值,共訓練6 d。d 7將平臺移除,讓小鼠自行游動60 s,記錄小鼠目標象限路程及穿越平臺的次數,測試在每日13 ∶00-17 ∶00之間進行。

1.2.3海馬組織ATP含量測定 I/R術后24 h,各組取6只小鼠的右側海馬組織用于ATP、ROS、MDA和SOD檢測,置于-80 ℃冰箱凍存。組織加入裂解液勻漿后,離心取上清。依照ATP檢測說明書操作。將標準品按照需要配制成一定的濃度梯度,每孔加100 μL稀釋后的ATP檢測工作液,然后向檢測孔中添加20 μL待測樣品或標準品,放入酶標儀,使用化學發光檢測每孔相對光單位(relative light unit,RLU)值。繪制標準曲線得出組織中ATP水平,除以上清液中蛋白濃度得出相對ATP含量。

1.2.4海馬組織ROS含量測定 取海馬組織剪碎,用PBS沖洗1遍。加入一定量酶消化液,消化20 min,而后使用尼龍網濾過組織,離心收集沉淀。將DCFH-DA與沉淀混勻,置于水浴鍋中孵育30 min。收集孵育后的懸液,離心收集沉淀,洗去殘余的DCFH-DA。離心,收集沉淀,用PBS重懸,使用多功能酶標儀測定其熒光信號。

1.2.5MDA和SOD含量測定 稱取海馬組織,加入一定量生理鹽水制備勻漿,離心取上清,檢測上清液蛋白濃度。依據試劑盒操作步驟,檢測海馬組織MDA和SOD水平。

1.2.6Western blot法檢測蛋白的表達 水迷宮實驗完成后,取海馬組織加入裂解液,加入磁珠研磨,冰上放置充分裂解,離心取上清,測蛋白濃度。取20 μg組織蛋白進行PAGE凝膠電泳,200 mA電流轉移至膜上,快速封閉液封閉20 min,將膜加入對應一抗中孵育過夜,再加入二抗繼續孵育1 h。滴加顯影液,采用凝膠成像儀化學發光顯影,蛋白條帶相對灰度值利用ImageJ軟件測定。

2 結果

2.1 七氟烷對小鼠潛伏期的影響如Fig 1所示,與HSR組相比,水迷宮實驗第4、5、6天,Sham組和Sevo組小鼠潛伏時間明顯縮短(P<0.01);與Sevo組比較,Sevo+EX527組和Sevo+ML385組小鼠潛伏時間延長(P<0.01)。提示EX527和ML385逆轉了七氟烷后處理對小鼠認知功能的保護作用。

Fig 1 Effect of sevoflurane on latency n=10)

2.2 七氟烷對小鼠目標象限路程與穿越平臺次數影響如Fig 2所示,與HSR組比較,Sham組和Sevo組小鼠平臺象限運動距離及穿越平臺次數明顯增加(P<0.05,P<0.01);與Sevo組比較,Sevo+EX527組和Sevo+ML385組小鼠平臺象限運動距離及穿越平臺次數明顯降低(P<0.01)。上述結果表明,七氟烷后處理對小鼠認知功能的保護與SIRT1和Nrf2相關。

Fig 2 Effect of sevoflurane on target quadrant distance and crossing platform n=10)

2.3 七氟烷對海馬ATP和ROS含量影響Fig 3結果顯示,與HSR組比較,Sham組和Sevo組小鼠海馬ATP含量明顯增加,ROS含量明顯減少(P<0.01);與Sevo組比較,Sevo+EX527組和Sevo+ML385組小鼠海馬ATP含量明顯降低,ROS含量明顯升高(P<0.01)。提示EX527和ML385逆轉了七氟烷后處理ATP和ROS水平。

Fig 3 Effect of sevoflurane on ATP (A) and ROS (B) contents in n=6)

2.4 七氟烷對海馬SOD和MDA水平影響如Fig 4所示,與HSR組相比,Sham組和Sevo組SOD活性增加,MDA含量降低(P<0.05,P<0.01);與Sevo組相比,Sevo+EX527組和Sevo+ML385組SOD活性降低,MDA含量升高(P<0.05)。提示SIRT1、Nrf2介導七氟烷后處理對小鼠的抗氧化作用。

Fig 4 Effects of sevoflurane on SOD activity (A) and MDA content (B) in n=6)

2.5 SIRT1、Nrf2和HO-1蛋白表達情況如Fig 5所示,與HSR組比較,Sham組和七氟烷組小鼠海馬SIRT1、Nrf2和HO-1表達上調(P<0.01);與七氟烷組比較,Sevo+EX527組和Sevo+ML385組小鼠海馬上述蛋白表達下調(P<0.05,P<0.01);Sevo+ML385組與七氟烷組比,SIRT1蛋白含量差異無顯著性。表明七氟烷后處理通過SIRT1/Nrf2/HO-1通路,發揮對I/R小鼠的保護作用。

Fig 5 Results of protein expression in five n=3)

3 討論

研究表明,失血性休克再灌注后表現為炎癥因子大量釋放、細胞凋亡、血腦屏障破壞等,會加劇缺血后腦組織和神經元的損傷[9]。Shi等[10]發現,七氟烷后處理可以減輕失血性休克復蘇后大鼠的腦梗死面積、神經細胞凋亡和認知功能障礙。本課題組前期研究也發現,七氟烷后處理可以改善腦I/R小鼠學習記憶能力[3]。研究證實,腦I/R損傷與氧化應激密切相關。在發生組織再灌注損傷的過程中,釋放的大量ROS會使呼吸鏈復合物的功能失活,而呼吸鏈的損傷進一步增加ROS的產生和積累,觸發一系列的細胞氧化損傷[11]。SOD是一種內源性抗氧化酶,能夠抑制機體的氧化應激反應。MDA是生物體氧化應激的代謝產物,能夠反映脂質過氧化的水平。因而,SOD的活性以及MDA的含量可以提示氧化損傷的水平。有研究表明,七氟烷后處理通過激活Akt/mTOR信號,改善線粒體損傷,增加SOD活性,降低MDA含量,降低線粒體ROS的產生,促進ATP的合成,減輕氧化應激來保護大鼠心臟免受I/R損傷[12]。本研究發現,七氟烷后處理使I/R小鼠海馬ROS、MDA含量減少,ATP含量和SOD活性升高,說明七氟烷后處理具有減輕失血性休克后海馬神經元氧化應激的作用。

SIRT1可以在多種信號轉導途徑中對蛋白質底物進行去乙酰化,調控基因表達、控制細胞周期進程,具有保護神經、調節細胞代謝和氧化應激的作用[13]。本課題組前期實驗利用小鼠失血性休克與復蘇模型,證實了七氟烷后處理通過增加SIRT1表達,減少失血性休克再灌注小鼠海馬神經元的凋亡[3]。SIRT1蛋白的升高可以緩解神經元的變性,降低促炎因子水平和線粒體損傷,減輕腦I/R損傷[14]。Song等[15]利用短暫性大腦中動脈閉塞實驗證實,促進SIRT1表達可以改善I/R后小鼠神經元損傷和細胞凋亡,抑制氧化應激。本實驗通過對七氟烷后處理小鼠注射SIRT1抑制劑EX527來減弱SIRT1的表達,小鼠行為學測試的潛伏期明顯延長,目標象限路程及穿越平臺次數明顯減少;海馬組織ROS、MDA含量升高,ATP水平和SOD活性降低,表明SIRT1參與七氟烷后處理改善腦I/R小鼠氧化應激和空間學習與記憶能力。

近年來,有研究指出SIRT1被激活后,可以通過促進Nrf2的表達改善氧化水平[16]。Nrf2是細胞對抗氧化損傷和保持氧化還原穩態的關鍵分子之一,Wang等[7]的研究表明,Nrf2可以通過促進HO-1的表達,抑制氧化應激引起的I/R損傷。本實驗中,HSR組小鼠海馬組織SIRT1、Nrf2、HO-1蛋白表達減少,七氟烷后處理上調了SIRT1、Nrf2的表達,并促進了其下游抗氧化蛋白HO-1的表達。相反,通過注射SIRT1抑制劑EX527降低了七氟烷后處理對蛋白表達的上調作用。

研究表明,HO-1能夠維持I/R大鼠血腦屏障的完整性,緩解腦I/R后的繼發性腦損傷和認知功能障礙[17]。HO-1可以提高線粒體膜電位,降低線粒體氧化產物,來抵御缺氧/復氧對細胞產生的氧化損害[8]。HO-1的缺失可以加重氧化應激損傷,而HO-1基因被激活后,可以改善氧化應激引起的復合物的功能障礙,增加線粒體內ATP的水平[18]。本研究在七氟烷后處理的基礎上,進一步使用ML385抑制小鼠中Nrf2的表達,發現小鼠海馬組織中Nrf2、HO-1蛋白表達有明顯減少,而SIRT1的表達與Sevo組比沒有明顯變化;ATP含量及SOD活性降低,MDA、ROS含量升高。同時,小鼠逃避潛伏期明顯增加,平臺象限運動距離及越過平臺次數減少。這些結果證明,七氟烷后處理可能通過激活SIRT1/Nrf2/HO-1信號通路,減少氧化應激,進而減輕腦I/R損傷。

綜上所述,七氟烷后處理可以通過增加SIRT1、Nrf2的表達,進一步活化HO-1,減輕氧化應激,從而減少腦I/R損傷,改善小鼠的空間學習與記憶能力。