枸杞籽油對亞急性衰老大鼠睪丸Nrf2/ARE通路和氧化損傷的影響

田瑞瑩,邢莎莎,虎 娜,馬文欣,劉 暢,劉自鈺,馬 彪,李佳陽,劉虎軍,白長財,陳冬梅,馬會明

(寧夏醫(yī)科大學 1.生育力保持教育部重點實驗室、2.基礎(chǔ)醫(yī)學院、3.臨床醫(yī)學院、4. 藥學院、5.總醫(yī)院寧夏干細胞與再生醫(yī)學重點實驗室, 寧夏 銀川 750004)

枸杞(Lyciumbarbarum)是“藥食同源”的道地藥材,具有降血壓、抗氧化、抗衰老等功效[1-2]。枸杞籽油(Lyciumbarbarumseedoil,LBSO),是枸杞籽經(jīng)過CO2超臨界萃取所得的一種功能油。已有報道LBSO可緩解UVB誘導的HaCaT的光損傷[3]、減輕氧化應激[4]、改善抑郁行為及認知功能障礙[5]。

機體衰老進程中伴隨著器官功能的退化,其中睪丸的衰老可引起男性生殖功能障礙及相應癥狀,嚴重影響中老年男性的生活質(zhì)量[6]。睪丸衰老時發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)退行性病變,如睪丸重量減輕,生精細胞散在分布,支持細胞稀少,精子數(shù)目遞減[7]。同時也伴隨著睪丸功能的減退,如血清激素水平變化和精液質(zhì)量(精子數(shù)量、精子活力)下降等[8]。研究證實衰老產(chǎn)生過多活性氧和自由基,引起機體氧化應激損傷,出現(xiàn)衰老[9],進而睪丸組織也會受到影響。已證實核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(NF-E2-ralated factor 2,Nrf2)/抗氧化反應元件(antioxidant responsive element,ARE)通路在維持機體細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)平衡和降低氧化應激造成損傷具有重要作用[10]。本課題組前期研究證實LBSO對D-半乳糖(D-galactose,D-gal)處理的衰老的睪丸支持細胞和衰老大鼠有明顯的抗炎作用[11],但目前關(guān)于發(fā)揮抗衰老作用鮮有報道。因此本研究旨在探索LBSO是否可以通過Nrf2/ARE通路抑制亞急性衰老大鼠氧化應激和清除氧自由基,進而改善衰老或減緩衰老進程。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級8周齡♂SD大鼠60只,動物許可證號：SCXK(寧)2020-0001,體質(zhì)量(200±20)g,購自寧夏醫(yī)科大學動物中心,實驗動物福利倫理審查編號No. IACUC-NYLAC-2020-007,所有大鼠分籠飼養(yǎng)于濕度56%～65%,溫度(20±3)℃的環(huán)境中,自由攝食和飲水。

1.2 藥物LBSO執(zhí)行標準：Q/QMSW0001S,購自寧夏杞明生物食品有限公司。

1.3 試劑D-gal(美國Sigma公司,貨號：G0750,純度>99%);鹽酸二甲雙胍片(metformin,Met;中美上海施貴寶制藥有限公司,批號：國藥準字H20023370,規(guī)格：0.5 g);β-半乳糖苷酶(β-gal)、Lamin B、β-actin、SOD2、NQO1以及GCLC抗體(北京博奧森公司,貨號：bs-13369R、bs-1840R、bs-0061R、bs-20668R、bs-23407R、bs-23393R);p16INK4A、p21Waf1/CiP1和p53抗體(沈陽萬類公司,貨號：WL01418、WL0362、WL01919);Nrf2抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司,貨號：AF0639);GAPDH、山羊抗小鼠-IgG抗體和山羊抗兔-IgG抗體(北京Lablead公司,貨號：G0100、S0100、S0101);γH2AX抗體(美國Cell Signaling Technology公司,貨號：60566);蛋白電泳試劑(上海雅酶生物科技有限公司,貨號：LK304);BCA蛋白定量試劑盒(凱基生物公司,貨號：KGP902);細胞、組織核蛋白提取試劑盒(上海尚寶生物科技有限公司,貨號：26131);ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,貨號：E-OSEL-R0003、E-EL-0060c、E-BC-K030-M、E-BC-K022-M);通用二步法試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,貨號：PV-9000)。

1.4 儀器全自動冷凍研磨儀(JXFSTPRP-CL型);雙目正置熒光顯微鏡(BX-51,日本奧林巴斯);蛋白電泳裝置(Mini-PROTEAN Tetra型,美國Bio-Rad公司);全波長酶標儀(EPoch型,美國BioTek公司);化學發(fā)光凝膠成像儀(ChemiDoc XRS,美國 Bio-Rad公司);石蠟包埋機(KD-BM II型,中國KEDEE公司);石蠟切片機(RM2235型,德國Leica公司);切片掃描儀(APerio LV1型,德國Leica公司)。

1.5 實驗方法

1.5.1動物分組以及處理方式 采用隨機數(shù)字法,將大鼠分成空白對照組(Control)、模型對照組(Model)、LBSO低劑量組(1 000 mg·kg-1)、LBSO中劑量組(1 750 mg·kg-1)、LBSO高劑量組(2 500 mg·kg-1)和陽性藥物二甲雙胍對照組(Met,300 mg·kg-1),每組10只。除空白對照組,其他各組通過D-gal(125 mg·kg-1)頸部皮下注射8周,建立亞急性衰老模型,給藥劑量按照本課題組文獻[4]報道;在皮下注射4周時,LBSO低、中和高劑量組繼續(xù)注射D-gal并同時灌胃LBSO 1 000、1 750、2 500 mg·kg-1,陽性藥物對照組繼續(xù)注射D-gal并同時灌胃二甲雙胍300 mg·kg-1,灌胃共持續(xù)4周,至第8周注射D-gal和灌胃同時結(jié)束,開始取材收集各組睪丸組織和血清。

1.5.2血清氧化相關(guān)因子水平以及血清激素水平ELISA法測定 取大鼠心臟血液,室溫靜置30 min后,4℃條件下10 000 r·min-1離心15 min后取上清,采用ELISA法檢測獲得血清樣品中氧化相關(guān)因子氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)以及激素睪酮(testosterone,T)、促卵泡激素(follicle stimulating hormone,FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone,LH)的水平,按試劑盒說明書中的步驟進行標準品制備、加樣、抗體孵育等操作,加入終止液后,酶標儀在450 nm波長下檢測每孔吸光度值(A值)。

1.5.3HE染色觀察大鼠睪丸組織的形態(tài)學變化 將取下的大鼠一側(cè)新鮮睪丸立即置于4%多聚甲醛中固定24 h后,將睪丸取出,在睪丸中間以及睪丸兩側(cè)進行表膜扎孔以便固定液更好滲透進睪丸內(nèi)部,再放入固定液中固定48 h后,經(jīng)梯度乙醇、二甲苯脫水浸蠟后行石蠟包埋,制備成5 μm石蠟切片后,65 ℃烘烤3 h,切片脫蠟復水后,HE染色,乙醇脫水,二甲苯透明后中性樹膠封片。光學顯微鏡下,觀察睪丸組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化。

1.5.4免疫組織化學染色 將睪丸組織石蠟包埋切片后,進行脫蠟、復水、抗原修復、一抗孵育(Nrf2、GCLC、NQO1、SOD2、β-gal和γH2AX抗體稀釋倍數(shù)均為1 ∶200)、二抗孵育、DAB顯色、蘇木精復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察,可以看到組織內(nèi)細胞呈現(xiàn)棕黃色或者是棕褐色,即為陽性表達區(qū)域。運用低倍鏡和高倍鏡調(diào)整觀察染色情況。

1.5.5睪丸組織總蛋白和核蛋白提取 依據(jù)細胞、組織總蛋白和核蛋白提取試劑盒步驟,取50 mg經(jīng)PBS潤洗的睪丸組織,加入500 μL Hypotonic Buffer置冰上勻漿20次,收集勻漿,置4 ℃條件下12 000 r·min-1離心20 min后靜置30 min,待分層后吸取上清至預冷的塑料管中,即為抽提得到的總蛋白。向沉淀中加入70 μL添加了PMSF的細胞核蛋白抽提試劑Extraction Buffer高速劇烈渦旋,每隔1～2 min高速劇烈渦旋15～30 s,再置冰上孵育共30 min,后于4 ℃條件下12 000 r·min-1離心10 min后取上清,即為抽提得到的細胞核蛋白,用于Nrf2核蛋白分析和檢測。

1.5.6Western blot檢測p16INK4A、p21Waf1/CiP1、p53、γH2AX、GCLC、NQO1和SOD2總蛋白及Nrf2核蛋白水平 取上述提取的組織總蛋白和核蛋白,使用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。按照文獻[9]的具體方法,蛋白變性SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、室溫封閉,加入一抗(p16INK4A、p21Waf1/CiP1、p53、γH2AX、GCLC、NQO1、SOD2)均(1 ∶1 000)、β-actin(1﹕5 000)和Nrf2核蛋白(1 ∶1 000)、核內(nèi)參Lamin B(1 ∶2 000)4 ℃孵育過夜。加入對應二抗(1 ∶10 000)室溫孵育1 h,后使用ECL發(fā)光液進行抗原抗體檢測。用ImageJ對結(jié)果進行灰度值分析。每組實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 亞急性衰老模型大鼠的鑒定形態(tài)學結(jié)果顯示,空白對照組大鼠睪丸組織中,精曲小管大小形狀正常,管壁完整,內(nèi)部各級生精細胞排列緊密整齊有序,精曲小管中心明顯可見精子;衰老模型組睪丸組織中,精曲小管管壁扭曲變形,各級生精細胞排列稀松、疏散且無序,二者差異明顯。免疫組化β-gal染色結(jié)果顯示,與空白組相比,衰老模型組睪丸組織中β-gal陽性表達升高(Fig 1A)。與空白對照組比較,衰老相關(guān)蛋白p16INK4A、p21Waf1/CiP1、p53和γH2AX在衰老模型組的表達明顯上調(diào)(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義(Fig 1B)。確定D-gal皮下注射成功制備了亞急性衰老大鼠模型。

2.2 LBSO對亞急性衰老大鼠睪丸組織形態(tài)學的影響與衰老模型組相比,LBSO各劑量組睪丸組織精曲小管管壁較完整,較相鄰精曲小管聯(lián)系緊密,形態(tài)未見明顯扭曲,各級生精細胞排列較整齊有序,中心可見正常精子(Fig 2);間質(zhì)細胞中β-gal表達陽性表達降低;支持細胞中γH2AX陽性表達降低(Fig 3-6)。

Fig 1 Identification of rats with subacute aging models n=3)

Fig 2 Effect of LBSO on testicular histomorphology in subacute aging rats (bar=50 μm)

Fig 3 Effect of LBSO on markers of testicular aging β-galactosidase in subacute aging rats (bar=50 μm)

Fig 4 Effect of LBSO on oxidative factor p16 in testis of subacute aging rats (bar=50 μm)

Fig 5 Effect of LBSO on oxidative factor p21 in testis of subacute aging rats (bar=50 μm)

Fig 6 Effect of LBSO on markers of testicular aging γH2AX in subacute aging rats (bar=50 μm)

2.3 LBSO對Nrf2蛋白表達的影響免疫組化結(jié)果顯示,與模型組相比,LBSO各劑量組睪丸組織的支持細胞中Nrf2核表達陽性升高(Fig 7)。

Fig 7 Elevated expression of Nrf2 protein nuclei in testicular tissue of subacutely aging rats (bar=20 μm)

2.4 LBSO對Nrf2/ARE通路相關(guān)蛋白表達水平的影響Western blot結(jié)果顯示,與衰老模型比較,LBSO各劑量組Nrf2/ARE通路相關(guān)蛋白Nrf2、GCLC、NQO1和SOD2的表達均明顯上升(P<0.05),差異具有統(tǒng)計學意義(Fig 8)。免疫組化結(jié)果顯示,與衰老模型比較,LBSO各劑量組Nrf2/ARE通路相關(guān)因子GCLC、NQO1和SOD2的表達水平陽性表達升高(Fig 9-11)。

Fig 8 Effect of LBSO on expression of Nrf2/ARE pathway correlated factors in testis tissue of subacute aging rats n=3)

Fig 10 Effect of LBSO on Nrf2/ARE pathway related factor NQO1 expression in testicular tissue of subacute aging rats (bar=50μm)

Fig 11 Effect of LBSO on Nrf2/ARE pathway related factor SOD2 expression in testicular tissue of subacute aging rats (bar=50μm)

2.5 LBSO對血清中氧化相關(guān)因子的影響ELISA檢測氧化因子結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組血清SOD和GSH水平均明顯降低,MDA水平明顯增加(P<0.05),差異具有統(tǒng)計學意義;與模型組相比,經(jīng)不同濃度LBSO和陽性藥物Met干預后,血清中SOD和GSH水平均有明顯升高,MDA水平明顯降低(P<0.05),差異具有統(tǒng)計學意義(Tab 1)。

Tab 1 Detection of oxidation factor levels in serum of rats in each group after LBSO treatment n=10)

2.6 LBSO對各血清中激素水平的影響ELISA結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組血清T和FSH水平均有明顯降低,LH水平明顯增加(P<0.05),差異具有統(tǒng)計學意義;與模型組相比,經(jīng)不同濃度經(jīng)LBSO和陽性藥物Met干預后,血清T和FSH水平均有明顯升高,LH水平明顯降低(P<0.05),差異具有統(tǒng)計學意義(Tab 2)。

Tab 2 Detection of hormone levels in serum of rats after LBSO treatment n=10)

3 討論

睪丸作為對外源性因素極其敏感的組織器官,隨著年齡的不斷增加,其生殖生理功能逐漸衰退,隨之也出現(xiàn)組織形態(tài)學和功能性的變化[12]。本研究采用D-gal制備的大鼠衰老模型,其睪丸組織形態(tài)學上出現(xiàn)生精細胞層數(shù)減少,各細胞之間的間隙變大,各級生精細胞都有不同程度的脫落,結(jié)果與李夢婷等[13]研究結(jié)果一致。HE與免疫組化結(jié)果顯示,LBSO干預組睪丸組織精曲小管管壁較完整,較相鄰精曲小管聯(lián)系緊密,形態(tài)未見明顯扭曲,各級生精細胞排列較整齊有序,中心可見正常精子;間質(zhì)細胞中β-gal表達陽性表達降低;研究結(jié)果顯示,模型組中衰老相關(guān)的生物標志分子p16INK4A、p21Waf1/CiP1、p53和γH2AX蛋白的表達明顯上調(diào),D-gal處理加速了衰老相關(guān)的生物學改變進程,這一亞急性衰老所致睪丸損傷結(jié)論與衰老相關(guān)生物學所述的損傷研究[14]的結(jié)論一致。p21是一種細胞周期調(diào)節(jié)因子,它處于p53上下游,可以透過與p53結(jié)合,控制損傷DNA的恢復和累積[15],作為細胞中感應DNA損傷最敏感的分子組蛋白變體H2AX(形成γ-H2AX)開始圍繞損傷點聚簇。推測LBSO干預可能會降低機體及細胞的氧化損傷所致的衰老,進而保護睪丸損傷。睪丸組織各細胞也會因為D-gal處理出現(xiàn)適應性反應,出現(xiàn)組織或細胞衰老現(xiàn)象,導致細胞周期改變,產(chǎn)生細胞的氧化應激反應。組織或細胞中氧化酶SOD、GSH和MDA等和DNA的活性改變,進而生成大量超氧陰離子以及氧化產(chǎn)物,會造成生物大分子結(jié)構(gòu)以及機體組織功能的損傷,最終引起機體以及細胞的老化[16]。本實驗ELISA檢測結(jié)果表明,LBSO治療組和陽性藥物治療組血清SOD和GSH水平有明顯上升,MDA水平明顯下降。這與SOD和GSH抗氧化、抗衰老、清除自由基的生理功能,起到中和毒性的作用,MDA間接地反映膜脂過氧化程度的作用等[17]理論是相符的。同時,衰老過程中多種激素水平出現(xiàn)異常或者細胞對激素的敏感性亦有所降低。當LBSO和陽性藥物治療時,下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)調(diào)控垂體LH的分泌,而LH可促進睪丸間質(zhì)細胞合成和分泌睪酮[8],促進生精細胞的發(fā)生和發(fā)育,抑制生精細胞凋亡。分泌過多的睪酮可進入血液循環(huán)系統(tǒng)到達垂體抑制LH與FSH的分泌,部分經(jīng)類固醇合成酶催化合成E2,后者再進行負反饋調(diào)節(jié)[18-19]。本實驗研究結(jié)果顯示,LBSO治療組和陽性藥物治療組血清激素睪酮和FSH含量明顯升高,LH含量明顯降低?？赡苁且驗長BSO通過下丘腦-垂體-性腺軸對睪丸的生殖功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。Nrf2作為調(diào)控抗氧化反應和氧化損傷的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[20],在誘導機體的抗氧化應答中起著重要作用,如調(diào)節(jié)氧化還原平衡、DNA修復和線粒體生理機能等。Nrf2通路的活化可上調(diào)多種抗氧化基因表達,降低組織氧化損傷[20]。在衰老過程中Nrf2通路以及靶基因均有表達降低的趨勢,本研究結(jié)果顯示,LBSO治療組和陽性藥物治療組可明顯提高亞急性衰老大鼠睪丸中Nrf2通路及其下游靶分子GCLC、SOD2和NQO1的蛋白表達水平,這可能是LBSO通過激活衰老睪丸組織中Nrf2通路,發(fā)揮抗氧化損傷的保護作用,進一步保護氧化損傷所致的睪丸組織衰老。綜上所述,本研究通過成功構(gòu)建亞急性衰老大鼠模型,觀察到LBSO可以減輕亞急性衰老大鼠睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷,降低氧化應激,改善生殖激素的紊亂。LBSO可能是通過上調(diào)Nrf2信號通路及其下游GCLC、SOD2和NQO1的表達水平,達到改善衰老大鼠睪丸氧化應激的作用。本研究為LBSO保護睪丸、抵抗睪丸衰老、提高睪丸功能提供了一定的理論依據(jù)。但LBSO在衰老大鼠睪丸組織中發(fā)揮抗氧化應激作用,是否是直接激活Nrf2信號通路,是否是多靶點共同發(fā)揮作用,是否是通過其他通路共同發(fā)揮抗氧化作用,這些問題需要進一步深入開展研究。