柚皮素下調(diào)RIP1-RIP3-MLKL信號(hào)通路抑制多囊卵巢綜合征大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡

呂向陽(yáng),任曉爽,張 良,許繼群

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院生殖遺傳科,山東 濟(jì)南 250011;2. 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬濟(jì)南婦幼保健院婦女保健科,山東 濟(jì)南 250001)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種持續(xù)無(wú)排卵性內(nèi)分泌疾病。近來(lái)大量研究證實(shí),胰島素抵抗、激素分泌紊亂、炎癥及氧化應(yīng)激,均可損傷卵巢顆粒細(xì)胞,導(dǎo)致PCOS患者卵巢卵泡發(fā)育不良及無(wú)排卵癥狀的發(fā)生[1]。卵泡顆粒細(xì)胞為卵母細(xì)胞的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,卵泡顆粒細(xì)胞凋亡會(huì)使卵泡生長(zhǎng)延遲,在PCOS的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[2]。壞死性凋亡,也叫做程序性壞死,其失調(diào)是許多炎癥性疾病的關(guān)鍵因素。最近的1項(xiàng)研究顯示,PCOS相關(guān)的顆粒細(xì)胞中多種差異基因與細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡途徑有關(guān)[3]。受體相互作用蛋白激酶1(receptor interaction protein kinase 1,RIP1)、RIP3和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like proteins,MLKL)是參與調(diào)節(jié)壞死性凋亡的主要分子,RIP1可與其家族蛋白R(shí)IP3相互作用,形成壞死復(fù)合體,介導(dǎo)壞死性凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)化,參與細(xì)胞死亡過(guò)程[4]。已有文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn),RIP1-RIP3-MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡參與癌癥、腦損傷、心臟損傷等多種疾病的發(fā)展[5]。然而,RIP1-RIP3-MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡是否也參與PCOS顆粒細(xì)胞凋亡過(guò)程,尚未見(jiàn)報(bào)道。

柚皮素是合成雌激素的天然替代物之一,其具有較好的抗炎、抗氧化應(yīng)激、改善性激素分泌紊亂、緩解卵巢顆粒細(xì)胞層減少等作用[6],提示柚皮素可能是治療PCOS的潛在藥物。但柚皮素抗卵巢顆粒細(xì)胞減少的作用是否與RIP1-RIP3-MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡途徑有關(guān),未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立大鼠PCOS模型對(duì)此進(jìn)行探究驗(yàn)證,以期闡明柚皮素抗PCOS顆粒細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,并為其開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SD大鼠,SPF級(jí),♀,體質(zhì)量200～210 g,6～7周齡,購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉)2020-0002]。大鼠于山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(魯)2022-0009],實(shí)驗(yàn)經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)：IACUC-01(20200327),符合3R原則。

1.2 試劑柚皮素(貨號(hào)：SND-675,規(guī)格：20 mg),購(gòu)自滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司;脫氫表雄酮(貨號(hào)：30099087),購(gòu)自深圳海思安生物技術(shù)有限公司;RIP1特異性抑制劑Nec-1(貨號(hào)：LM4359),購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司;RIP1-RIP3-MLKL壞死信號(hào)激活劑(caspase-8抑制劑Z-VAD-fmk,貨號(hào)：MBS842218-C),購(gòu)自艾美捷科技有限公司;大鼠白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)ELISA試劑盒(貨號(hào)：MS23245)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)ELISA試劑盒(貨號(hào)：MS35245),均購(gòu)自北京博沃爾斯生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：E-CK-A211),購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;抗體RIP1、磷酸化RIP1(p-RIP1)、RIP3、磷酸化RIP3(p-RIP3)、MLKL、磷酸化MLKL(p-MLKL),均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 儀器BX-51型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司);iMark680多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司);FACScan流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Biosciences公司)。

1.4 方法

1.4.1模型建立及分組 SD大鼠參照文獻(xiàn)[7]方法,于頸背部皮下注射脫氫表雄酮(脫氫表雄酮溶于注射用油劑,30 mg·kg-1,2 mL·kg-1,每天1次,連續(xù)4周),建立PCOS模型(以第10周檢查取陰道涂片,出現(xiàn)角化細(xì)胞、動(dòng)情周期不完整,并出現(xiàn)血清睪酮水平異常升高,視為造模成功)。大鼠隨機(jī)分為：模型組、柚皮素組(100 mg·kg-1)、Nec-1組、Z-VAD-fmk組、柚皮素+Z-VAD-fmk組,每組15只;另取SD大鼠在相同部位于相同時(shí)間注射油劑2 mL·kg-1,作為正常對(duì)照組。

柚皮素組參照文獻(xiàn)[6]灌胃給予柚皮素(100 mg·kg-1,10 mL·kg-1,每天1次,連續(xù)7 d);Nec-1組參照文獻(xiàn)[8]經(jīng)腹腔注射給予RIP1特異性抑制劑Nec-1(6 mg·kg-1,每天1次,連續(xù)7 d);Z-VAD-fmk組參照文獻(xiàn)[9]經(jīng)尾靜脈注射caspase-8抑制劑Z-VAD-fmk(1.5 mg·kg-1,每天1次,連續(xù)7 d);柚皮素+Z-VAD-fmk組灌胃給予柚皮素(100 mg·kg-1)的同時(shí),尾靜脈注射給予Z-VAD-fmk進(jìn)行治療;模型及正常對(duì)照組灌胃給予10 mL·kg-1生理鹽水。

1.4.2流式細(xì)胞術(shù)測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞壞死率及凋亡率 隨機(jī)取5只各組大鼠,處死,取左右卵巢組織,參照文獻(xiàn)[10]中操作方法,分離并收集卵巢組織中的顆粒細(xì)胞,制成卵巢顆粒細(xì)胞液,取2×106個(gè)細(xì)胞,按Annexin V-FITC/PI雙染液說(shuō)明書(shū)方法,染色孵育后,流式上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞死亡方式,并計(jì)算壞死率及凋亡率。

1.4.3HE染色觀察卵巢形態(tài) 斷頭處死大鼠,取左右卵巢組織,左側(cè)卵巢制成厚20 μm的冰凍切片,取相同部位切片,復(fù)溫、水化后行HE染色,光鏡下觀察卵巢組織顆粒細(xì)胞及卵泡細(xì)胞形態(tài)變化。右側(cè)卵巢組織置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4免疫組化法檢測(cè)卵巢組織p-RIP1陽(yáng)性表達(dá) 相同卵巢組織冰凍切片,復(fù)溫、水化、透化處理后,滴加1 ∶200的p-RIP1一抗孵育過(guò)夜,生物素標(biāo)記的IgG二抗孵育50 min,DAB顯色及蘇木精復(fù)染后,光鏡下觀察拍照,Image-Pro Plus 6.0軟件檢測(cè)單位面積內(nèi),p-RIP1陽(yáng)性染色的平均光密度值。

1.4.5ELISA法檢測(cè)卵巢組織炎癥因子IL-1β、TNF-α水平 取液氮中保存的卵巢組織,解凍、剪碎、勻漿后取勻漿液,ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β、TNF-α水平。

1.4.6Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 液氮中保存的卵巢組織,解凍、剪碎,組織裂解液裂解及冰上研磨,提取勻漿液中蛋白,BCA法檢測(cè)蛋白總濃度,用50 μg蛋白行電泳、電轉(zhuǎn)膜操作。孵育盒中滴加1 ∶1 000稀釋的RIP1、p-RIP1、caspase-8、RIP3、p-RIP3、MLKL、p-MLKL一抗,以及1 ∶2 000稀釋的β-actin內(nèi)參抗體孵育24 h,再與二抗室溫孵育2 h,化學(xué)發(fā)光液顯色、曝光,Alpha Ease FC軟件計(jì)算蛋白條帶相對(duì)灰度值。

1.4.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 表示符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù),SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)行多組間比較及組間多重比較。

2 結(jié)果

2.1 柚皮素對(duì)大鼠卵巢組織病理形態(tài)的影響由Fig 1的HE染色可見(jiàn),正常對(duì)照組大鼠卵巢組織卵泡、卵母細(xì)胞正常,顆粒細(xì)胞層數(shù)為8～12層;模型組卵巢組織可見(jiàn)卵泡囊性擴(kuò)張、卵泡閉鎖且內(nèi)無(wú)卵母細(xì)胞,顆粒細(xì)胞層減少等病理?yè)p傷嚴(yán)重;柚皮素組及Nec-1組大鼠卵泡顆粒細(xì)胞層增多,閉鎖卵泡減少;Z-VAD-fmk組大鼠卵泡囊性擴(kuò)張、卵泡閉鎖,顆粒細(xì)胞層減少最嚴(yán)重;柚皮素+Z-VAD-fmk組上述病理?yè)p傷較柚皮素組嚴(yán)重,較Z-VAD-fmk組有明顯改善。

Fig 1 HE staining of ovarian tissue of rats in each group(×40)

2.2 柚皮素對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞壞死率及凋亡率的影響流式檢測(cè)圖中,象限(Q2+Q4)總和為凋亡細(xì)胞數(shù)目,Q1象限為壞死細(xì)胞數(shù)目,Q3為生存細(xì)胞數(shù)目。如Fig 2所示,與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞壞死率、凋亡率升高(P<0.01)。與模型組相比,柚皮素組、Nec-1組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞壞死率、凋亡率降低(P<0.01),柚皮素組對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞壞死率、凋亡率降低作用優(yōu)于Nec-1組;Z-VAD-fmk組大鼠凋亡率較模型組降低(P<0.05),壞死率較模型組進(jìn)一步升高(P<0.05)。與柚皮素組相比,柚皮素+Z-VAD-fmk組大鼠凋亡率降低(P<0.05),壞死率升高(P<0.01);與Z-VAD-fmk組相比,柚皮素+Z-VAD-fmk組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞壞死率、凋亡率降低(P<0.01)。

Fig 2 Annexin V-FITC/PI double staining used to detect apoptosis rate and necrosisrate of ovarian granulosa cells in each

2.3 柚皮素對(duì)大鼠卵巢組織IL-1β、TNF-α水平的影響如Fig 3所示,與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠卵巢組織IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.01)。與模型組相比,柚皮素組、Nec-1組大鼠卵巢組織IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.01),柚皮素組對(duì)卵巢組織IL-1β、TNF-α水平降低作用優(yōu)于Nec-1組;Z-VAD-fmk組大鼠卵巢組織IL-1β、TNF-α水平較模型組升高(P<0.01)。與柚皮素組相比,柚皮素+Z-VAD-fmk組大鼠卵巢組織IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.01);與Z-VAD-fmk組相比,柚皮素+Z-VAD-fmk組大鼠卵巢組織IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.01)。

Fig 3 Comparison of levels of inflammatory factors (IL-1β, TNF-α) in ovarian

2.4 柚皮素對(duì)大鼠卵巢組織p-RIP1陽(yáng)性表達(dá)的影響免疫組化染色顯示(Fig 4),p-RIP1在正常對(duì)照組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞層中呈弱陽(yáng)性表達(dá),在模型組卵巢顆粒細(xì)胞層中呈強(qiáng)陽(yáng)性(紅棕色)表達(dá),模型組大鼠卵巢組織顆粒細(xì)胞中p-RIP1陽(yáng)性表達(dá)高于正常對(duì)照組(P<0.01)。與模型組相比,柚皮素組、Nec-1組大鼠p-RIP1陽(yáng)性表達(dá)降低(P<0.01),柚皮素組p-RIP1陽(yáng)性表達(dá)降低強(qiáng)度優(yōu)于Nec-1組。Z-VAD-fmk組大鼠卵巢組織p-RIP1陽(yáng)性表達(dá)較模型組升高(P<0.01)。與柚皮素組相比,柚皮素+Z-VAD-fmk組大鼠卵巢組織p-RIP1陽(yáng)性表達(dá)升高(P<0.01);與Z-VAD-fmk組相比,柚皮素+Z-VAD-fmk組大鼠卵巢組織p-RIP1陽(yáng)性表達(dá)降低(P<0.01)。

Fig 4 p-RIP1 immunohistochemical staining of rat ovariantissue and comparison of positive expression

2.5 柚皮素對(duì)大鼠RIP1-RIP3-MLKL壞死途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如Fig 5所示,與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL升高(P<0.01)。與模型組相比,柚皮素組、Nec-1組大鼠p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL降低,柚皮素組對(duì)壞死途徑相關(guān)蛋白的降低作用優(yōu)于Nec-1組。Z-VAD-fmk組大鼠p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL比值較模型組進(jìn)一步升高(P<0.01)。柚皮素+Z-VAD-fmk組大鼠p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL比值高于柚皮素組;與Z-VAD-fmk組相比,柚皮素+Z-VAD-fmk組大鼠p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL比值降低(P<0.01)。

Fig 5 Expression of p-RIP1/RIP1, p-RIP3/RIP3 andp-MLKL/MLKL in rat ovarian

3 討論

卵巢顆粒細(xì)胞為卵泡內(nèi)的大細(xì)胞群,可為卵泡發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng),并維持性激素的分泌[2]。PCOS患者血糖、血脂、性激素分泌紊亂、胰島素抵抗、炎癥刺激,均可誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞老化、凋亡,從而阻滯小竇卵泡發(fā)育,導(dǎo)致PCOS排卵異常并影響生育[11]。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn),PCOS患者卵泡液、顆粒細(xì)胞中存在IL-1β、TNF-α炎性因子及睪酮水平升高現(xiàn)象,并認(rèn)為睪酮水平可能誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞向卵泡液、顆粒細(xì)胞趨化而誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠卵巢中閉鎖卵泡增多,顆粒細(xì)胞減少,卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率、壞死率均升高,卵巢組織中炎癥因子(IL-1β、TNF-α)水平均高于正常對(duì)照組,提示PCOS大鼠出現(xiàn)炎癥、顆粒細(xì)胞凋亡、壞死現(xiàn)象,表明造模成功。柚皮素為二氫黃酮類成分,其具有較好的降糖、降脂、抗炎、抗凋亡及抗氧化應(yīng)激、降低胰島素抵抗等作用[13]。Hong等[14]發(fā)現(xiàn),柚皮素可緩解PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞層減少等病理?yè)p傷。本研究發(fā)現(xiàn),柚皮素在緩解PCOS大鼠顆粒細(xì)胞減少、卵泡閉鎖等病理?yè)p傷的同時(shí),還降低卵巢顆粒細(xì)胞壞死率及凋亡率,抑制卵巢炎癥因子(IL-1β、TNF-α)分泌,證實(shí)柚皮素可能為防治PCOS顆粒細(xì)胞凋亡的潛在藥物。然而,柚皮素促進(jìn)PCOS卵巢顆粒細(xì)胞生存的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制,還不明確。

壞死性凋亡不同于凋亡和其他形式的程序性細(xì)胞壞死,其不依賴于caspase活性,但需要RIP3調(diào)控的MLKL磷酸化,MLKL的磷酸化使MLKL在質(zhì)膜上產(chǎn)生孔復(fù)合體,從而導(dǎo)致?lián)p傷相關(guān)分子模式的分泌、細(xì)胞腫脹和膜破裂[15]。RIP1是調(diào)控壞死性凋亡的關(guān)鍵蛋白,在炎癥、凋亡、感染、應(yīng)激等條件下,RIP1的K117、K627、K377位點(diǎn)去泛素化修飾,可促進(jìn)RIP1發(fā)生自身磷酸化活化,而啟動(dòng)死亡、凋亡及存活等信號(hào)的傳導(dǎo)及傳遞[16]。已有研究發(fā)現(xiàn),磷酸化的RIP1可誘導(dǎo)RIP3發(fā)生自身磷酸化,并與其結(jié)合形成壞死小體,激活MLKL,使MLKL磷酸化形成寡聚體,來(lái)破壞細(xì)胞完整性,介導(dǎo)細(xì)胞壞死性凋亡的產(chǎn)生[17]。本研究發(fā)現(xiàn),PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中p-RIP1陽(yáng)性表達(dá)異常升高,其下游RIP3和MLKL的磷酸化水平均增加,表明PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中RIP1-RIP3-MLKL途徑處于活化狀態(tài)。提示RIP1-RIP3-MLKL途徑的激活可能是介導(dǎo)PCOS大鼠顆粒細(xì)胞壞死性凋亡的可能機(jī)制。

RIP1的特異性抑制劑Nec-1可抑制RIP1去泛素化修飾,阻斷RIP1磷酸化激活,抑制RIP1-RIP3-MLKL壞死小體形成介導(dǎo)的壞死性凋亡的發(fā)生,促進(jìn)細(xì)胞存活。本研究用RIP1特異性抑制劑Nec-1阻斷PCOS大鼠卵巢組織中RIP1磷酸化活化后,RIP1-RIP3-MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡途徑被抑制,卵巢顆粒細(xì)胞壞死率、凋亡率均降低,提示阻斷顆粒細(xì)胞RIP1-RIP3-MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡途徑可抑制PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),改善PCOS卵巢卵泡及顆粒細(xì)胞病理?yè)p傷。此外,本研究發(fā)現(xiàn)柚皮素抑制RIP1-RIP3-MLKL壞死性凋亡途徑活化的作用優(yōu)于Nec-1,其對(duì)PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡改善效果最明顯,提示柚皮素促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞存活的作用可能與抑制RIP1-RIP3-MLKL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。caspase-8可通過(guò)RIP1和RIP3的裂解,抑制壞死性凋亡,如果caspase-8活性被阻斷,RIP3即被募集到復(fù)合物中,形成壞死小體,引發(fā)細(xì)胞壞死性凋亡。caspase-8抑制劑Z-VAD-fmk可抑制caspase-8凋亡途徑活化,促進(jìn)細(xì)胞向RIP1-RIP3-MLKL壞死性凋亡方向發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn),使用Z-VAD-fmk抑制caspase-8活性后,卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率有所改善,但RIP1-RIP3-MLKL壞死性凋亡途徑活化最嚴(yán)重,顆粒細(xì)胞壞死率最高,大鼠卵泡閉鎖最嚴(yán)重,且caspase-8抑制劑Z-VAD-fmk可部分減弱柚皮素改善PCOS炎癥、卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的作用。提示柚皮素對(duì)PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的抑制作用可能是通過(guò)阻斷RIP1-RIP3-MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,柚皮素可能通過(guò)阻斷RIP1-RIP3-MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡途徑活化,抵抗PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。本研究為柚皮素治療PCOS提供一定參考,但PCOS卵巢顆粒細(xì)胞死亡機(jī)制還可能與其他途徑有關(guān),柚皮素改善PCOS卵巢損傷,促進(jìn)顆粒細(xì)胞存活的其他機(jī)制,還需繼續(xù)深入研究。