醬香型白酒釀造微生物多樣性研究進展

劉曉柱，黃名正，唐維媛，于志海，許存賓

貴州理工學院食品藥品制造工程學院（貴陽 550003）

醬香型白酒作為我國主流香型之一的白酒，歷史悠久，源遠流長[1]。以紅纓子糯高粱為主要釀造原料，通過高溫制曲、高溫堆積、高溫發酵、高溫餾酒等工藝生產而成的醬香型白酒，醬香突出、香氣優雅細膩，酒體豐滿醇厚[2]。醬香型白酒獨特的香氣特性和風味特征，既受釀造原料的影響，也受發酵工藝及微生物代謝活動的制約[3]。

醬香型白酒復雜的固體發酵工藝涉及大量釀造微生物的相互作用，包括細菌類、真菌類（酵母菌、霉菌）及放線菌類微生物種群[4]。不同的醬香型白酒釀造工序中微生物種屬多樣性與動態變化特點不同，由此產生的酒體風格特性差異較大，表明醬香型白酒釀造微生物具有多樣性和時空特異性，也暗示醬香型白酒釀造微生物與酒體風味特性的重要關聯性。綜述近年來國內在醬香型白酒釀造微生物多樣性方面的研究進展，以期為醬香型白酒釀造微生物的選育和酒體品質調控提供理論參考。

1 醬香型白酒釀造工序微生物多樣性

醬香型白酒生產工藝較為獨特，1年為1個完整的生產時間，含2次投糧、9次蒸煮、8次發酵、7次取酒，即為“12987”工藝。醬香型白酒整個生產工藝與微生物密切相關的環節包括制曲、堆積發酵、窖池發酵等環節[5]。

1.1 制曲

曲為酒之骨，好曲出好酒。高溫制曲是醬香型大曲主要特點，通過高溫篩選、富集耐熱微生物種群，為醬香型白酒生產提供糖化劑和發酵劑，進而影響醬香型白酒的風格和品質的形成[6]。

孫利林等[7]采用高通量測序技術比較2個醬香酒廠大曲微生物種群結構組成，結果發現兩酒廠大曲優勢細菌主要為桿菌屬（Bacillaceae），優勢真菌主要為曲霉屬（Aspergillus）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和嗜熱真菌屬（Thermomyces）。盡管兩酒廠大曲細菌和真菌種群組成相似，但它們的豐度卻不盡相同，如2個酒廠大曲中Aspergillus占比分別為55.00%和7.58%，Thermoascus占比分別為28.11%和49.85%。黃娜等[8]比較不同顏色（黑色、褐色、黃色）醬香型大曲微生物的群落結構組成，結果發現不同顏色大曲特征微生物具有較大差異，Thermomyces、嗜糖假單胞菌屬（Pelomonas）、螯臺球菌屬（Chelatococcus）、副球菌屬（Paracoccus）為黃色大曲特征微生物，被孢霉屬（Mortierella）為褐色大曲特征微生物，Thermoascus和鐮刀菌屬（Fusarium）為黑色大曲特征微生物。不同顏色大曲理化指標（酸度、還原糖、淀粉、酯化力）、酶活（糖化酶、液化酶）、揮發性風味物質也不相同，可能是由于微生物種群差異造成的。龐澤敏等[9]對比分析北京與貴州醬香大曲微生物種群組成差異，結果表明兩個地區大曲優勢細菌屬為Bacillaceae，包括海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）、克氏桿菌屬（Kroppenstedtia）及Scopulibacillus等，優勢真菌屬則為Thermoascu、Thermomyces和Aspergillus。謝丹等[10]探究醬香型大曲儲存過程中微生物群落變化特點，結果發現大曲中可培養微生物總體數量先增加后降低，優勢細菌為乳桿菌屬（Lactobacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、腸桿菌屬（Enterobacter）及Kroppenstedtia；優勢真菌為Trichomonascus、Thermomyces及絲衣霉屬（Byssochlamys）。

此外，黃曉寧等[11]比較醬香型大曲與濃香型大曲微生物多樣性，結果發現2種大曲中優勢細菌為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），優勢真菌差異較大，傘狀毛霉（Lichtheimiacorymbifera）和多變擬青霉（Paecilomycesvariotii）為醬香型大曲優勢真菌，濃香型大曲優勢真菌為謝瓦氏曲霉（Aspergillus chevalieri）和米曲霉（Aspergillus oryzae）。

1.2 堆積發酵

白酒的糖化堆積發酵暴露在釀造環境中，與空氣相接觸，可網羅、富集大曲與環境微生物，有助于微生物代謝產生多種風味物質，達到培菌增香目的，為窖池發酵做準備[12]。但醬香型白酒堆積發酵與其他香型白酒堆積發酵不同，其發酵溫度較高，達50 ℃以上。因而，醬香型白酒堆積發酵微生物種群類別及其變化特點與其他香型白酒相比具有一定差異性。

吳成等[13]采用高通量測序技術與純培養相結合方法解析造沙輪次堆積發酵微生物演變規律，研究發現堆積發酵不同階段微生物種群組成不同，在堆積發酵的前期和中期，優勢細菌為Kroppenstedtia、Bacillus、UnclassifiedThermoactinomycetaceae及UnclassifiedBacillaceae。優勢真菌為Thermomyces、畢赤酵母屬（Pichia）、Byssochlamys、Aspergillus。在堆積發酵末期，優勢細菌和真菌則演變為乳桿菌屬（Lactobacillus）和Pichia。這些微生物菌群是驅動造沙輪次堆積發酵的優勢微生物。進一步分析微生物種群與酒醅理化指標的關系發現，Lactobacillus、Acetobacter、Pichia、酵母菌屬（Saccharomyces）與酒醅溫度、葡萄糖含量之間呈現顯著正相關的關系，而與水分呈現顯著負相關的關系。姜明慧等[14]采用單一的高通量測序技術研究醬香型白酒下沙輪次堆積發酵6個階段（起堆、堆積第2天、復式堆積前、復式堆積后、復式堆積10 h、復式堆積高溫點）細菌與真菌群落變化規律。在堆積發酵6個時間點檢測到細菌屬的微生物分別為113，134，176，169，198和207個，乳酸菌屬（Lactobacillus、Weissella、Enterococcus、Pediococcus、Enterobacter）為其優勢細菌；檢測到真菌屬微生物分別為51，79，60，105，121和166個，生香酵母（Dipodascus、Dipodascaceae、Trichosporon）為其優勢真菌。該研究與吳成等[13]鑒定造沙堆積發酵階段優勢微生物種群具有一定差異性。推測其原因可能是地域不同導致，吳成等研究對象為南方醬香（貴州）白酒堆積發酵酒醅，姜明慧等研究對象則為北方醬香（山東）白酒堆積發酵酒醅。

涂昌華等[15]分析下沙輪次與造沙輪次堆積發酵過程中酒醅微生物與溫度的關系，研究發現在堆積發酵的初期，細菌群體數量高于酵母菌，隨著堆積發酵進行，細菌和酵母菌的數量均逐漸增加。酒醅溫度升高，抑制微生物數量的增加，溫度達到50 ℃后，酒醅中細菌和酵母菌的數量均降低。

除下沙和造沙輪次外，不少學者還對醬香型白酒其他輪次堆積發酵微生物多樣性進行研究。黃蘊利等[16]、張春林等[17]鑒定出后壁門（Firmicutes）、變形門（Proteobacteria）、子囊門（Aseomycota）、擔子門（Basidiomycota）為第2輪次堆積酒醅主要細菌和真菌菌群。其中，優勢細菌為Bacillus、Oceanobacillus、裸胞殼屬（Emericella）、Lactobacillus、Thermoactinomyces等，優勢真菌屬為Aspergillus、Pichia、假絲酵母屬（Candida）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）等。張春林等[17]研究發現酒醅淀粉和總酸含量影響Aspergillus、Emericella菌群豐度，兩者呈正相關，酒醅溫度、粗蛋白和還原糖含量也影響Emericella菌群豐度，它們之間呈負相關。鄧子文等[18]對襄陽市醬香型白酒第4輪次正常堆積發酵、“腰線”微生物多樣性進行比較分析，結果發現“腰線”酒醅中乳酸菌、細菌、酵母及霉菌的豐度均高于正常發酵酒醅；β多樣性分析結果表明，“腰線”處酒醅中Bacillus、Byssochlamys豐度顯著高于正常酒醅，而Pichia、酵母屬（Saccharomyces）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）和接合酵母屬（Zygosaccharomyces）豐度則顯著低于正常酒醅。吳成等[19]從第4輪次堆積發酵酒醅中鑒定出Kroppenstedtia、Sphingobium類細菌和Kazachstania、Aspergillus類真菌。該研究進一步發現酒醅的水分與Pichia呈正相關，與Thermomyces、Byssochlamys、Aspergillus等真菌呈負相關；酒醅淀粉、還原糖含量與Bacillus呈正相關，與Pichia呈負相關。此外，酒醅香氣物質中的醇類含量與酵母菌顯著正相關，酸類、酯類等含量與絲狀真菌和細菌顯著正相關。Wang等[20]對醬香型白酒7輪次堆積發酵酒醅微生物進行全面解析，不同輪次酒醅微生物種群組成不同，各有特點。但不同輪次酒醅也具有相似的優勢微生物種群，如Bacillus、慢生芽胞桿菌屬（Lentibacillus）、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lactobacillus等細菌類以及Thermomyces、Byssochlamys、Thermoascus、Aspergillus等真菌類。

1.3 窖池發酵

堆積發酵以培菌為主要目的，發酵結束后酒醅便轉移至窖池內，進入窖池發酵階段。醬香型白酒發酵窖池一般由長條石或方塊石砌成，窖底以窖泥為主。酒醅轉移至窖池內，窖泥封頂后進行約30 d的窖池發酵。針對窖池發酵階段，主要分析窖池內酒醅[21]和窖底泥微生物多樣性[22]。

王莉等[23]發現窖底泥微生物多樣性低于酒廠周邊環境土壤微生物多樣性。利用高通量測序技術鑒定出窖底泥主要微生物為乳桿菌科（Lactobacillaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）等厭氧微生物。胡峰等[24]對“大回酒”（第3，第4和第5輪次）窖池發酵酒醅中酵母菌、細菌和霉菌種群變化規律的研究結果發現，隨著發酵進行，窖池內酵母菌與霉菌數量逐漸降低，細菌數量在發酵初期降低，發酵中后期保持穩定。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces baillii）、地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）和解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）分別被鑒定為“大回酒”窖池酒醅中優勢酵母菌和優勢細菌，暗示這些微生物種群對“大回酒”醬香典型體的形成具有不可或缺的作用。

此外，張晶等[25]比較2個車間窖池微生物多樣性差異性，結果發現Acetilactobacillus、Bacillus和Kroppenstedtia為窖池內優勢細菌屬，Pichia、Saccharomyces、Byssochlamys為窖池內優勢酵母菌屬；Bacillus、Kroppenstedtia和Pichia、Saccharomyces在2個車間的窖池豐度具有顯著性差異，車間L4窖池內細菌和酵母菌豐度整體高于車間L1窖池；酒醅中葡萄糖、乙酸、乙醇含量的變化是驅動微生物種群演化的內在因子，證實發酵初始微生物多樣性影響發酵過程理化因素的變化，進而影響微生物種群多樣性，最終調控發酵代謝多樣性。

2 醬香型白酒釀造環境微生物多樣性

胡小霞[26]對茅臺鎮醬香型白酒釀造環境中細菌、真菌群落結構進行解析。釀造環境包括車間內和車間外兩部分，車間內包括玻璃、晾堂地面、配電箱與消防箱表面以及不易打掃的角落等場所，車間外主要為地面部分。研究從釀造環境樣品中共檢測到23個門、561個屬細菌，其中鞘脂桿菌屬（Sphingobacterium）、泛菌屬（Pantoea）、Kroppenstedtia、不動桿菌屬（Acinetobacter）、Enterobacter、Lentibacillus、假單胞菌屬（Pseudomonas）、unclassified fEnterobacteriaceae為各釀造區域共有優勢細菌屬微生物種群；該研究還從釀造環境中檢測到4個門、212個屬真菌，其中Wallemia、Aspergillus、覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、Thermoascus、Wickerhamomyces、unclassified fSaccharomycetaceae為各釀造區域共有優勢真菌屬微生物種群。

3 醬香型白酒釀造微生物分布時空特異性

3.1 時間特異性

左乾程[27]解析不同季節清醬香型白酒發酵微生物菌群結構多樣性，結果發現從春、夏、秋、冬4個季節發酵酒醅中共鑒定出24個門、499個屬細菌，6個門、251個屬真菌。優勢細菌鑒定為Bacillus、葡糖桿菌屬（Gluconobacter）、Lactobacillus、Enterobacter、Kroppenstedtia等19個屬，隨著時間的變化，4個季節發酵酒醅中細菌演變規律存在一定差異性，最終均演變為Lactobacillus為主導地位。優勢真菌鑒定為Saccharomyces、Saccharomycopsis、Wickerhamomyces、Zygosaccharomyces、有孢圓酵母屬（Torulaspora）等20個屬。與清香型相比，Gluconobacter、埃希氏桿菌屬（Escherichia）、Kozakia等為清醬香型白酒特有優勢細菌屬微生物，Saccharomyces、Cyberlindnera、黃絲曲霉屬（Talaromyces）為清醬香型白酒特有優勢真菌屬微生物。

有研究揭示不同輪次醬香型白酒釀造微生物種屬多樣性及動態變化。Xu等[28]分析第1輪次（包括下沙和造沙）至第3輪次窖池微生物多樣性變化，結果發現第1輪次和第2輪次發酵起始階段優勢細菌均為枝芽胞桿菌屬（Virginacil）和Oceanobillus，隨著發酵的進行，它們的豐度逐漸降低；相反，Lactobacillus的豐度則逐漸增加，并逐漸取代Virginacil、Oceanobillus成為優勢菌，并維持至該輪次發酵結束；第3輪次發酵起始優勢種群包括Lactobacillus、Oceanobacillus、Virgibacillus。Lactobacillus的豐度隨發酵進行逐漸降低，Oceanobacillus和Virgibacillus的豐度則逐漸增加；前3個輪次酒醅中優勢真菌為伊薩酵母屬（Issatchenkia）、Byssochlamys、Saccharomyces，Byssochlamys在前3個輪次發酵起始時為其優勢菌，豐度隨發酵進行而逐漸降低，在發酵中后期其主導地位被其他種屬酵母所取代。Wang等[29]研究第5和第6輪次酒微生物種群結構組成與風味物質之間的關系。從第5輪次和第6輪次堆積發酵和窖池發酵酒醅中鑒定出的優勢細菌屬，分別為Lactobacillus、Oceanobacillus和Virgibacillus，與前3個輪次優勢微生物相同[28]。Oceanobacillus、Virgibacillus在堆積發酵的第1和第3天為優勢菌，Lactobacillus為第5天優勢菌。Oceanobacillus、Virgibacillus為窖池發酵第1天優勢菌，在發酵第15天優勢菌演變為Lactobacillus，并維持到發酵結束（第30天）。盡管2個輪次優勢微生物種屬類別相同，但它們的豐度組成具有一定差異性。如Lactobacillus在第6輪次堆積發酵的第1天豐度為0.15±0.06，其在第5輪次相同時間點的豐度僅為0.04±0.02，低于第6輪次。第5輪次和第6輪次堆積發酵和窖池發酵酒醅優勢真菌為Issatchenkia、Thermoascus和Thermomyces。在堆積發酵和窖池發酵的第1天，Thermoascus和Thermomyces的豐度高于Issatchenkia。但Issatchenkia的豐度迅速增加，并在發酵的第3天成為優勢菌。而其他優勢真菌的豐度，如Thermoascus、Thermomyces、Aspergillus則逐漸降低。

此外，萬勇等[30]采用活菌計數法比較醬香型白酒7個輪次酒醅中微生物群體變化規律。研究發現：堆積發酵酒醅中微生物數量呈現先增加后降低趨勢，而出窖酒醅中微生物群體數量呈現整體下降趨勢；同一輪次堆積發酵酒醅不同位置微生物數量不同，中、下層微生物數量高于上層。

3.2 空間特異性

醬香型白酒主要產于貴州、四川、湖南、山東、北京等地，因而在地域上又可被分為南方醬香和北方醬香。由于釀造微生物分布具有空間特異性，造就不同地域醬香白酒風味迥異。

黃慧芹等[31]研究發現第4輪次入窖酒醅中優勢細菌和真菌分別為Lactobacillus、Virgibacillus、Kroppenstedtia和Thermoascus、Aspergillus、Issatchenkia。在整個發酵過程中以14 d為分界線，發酵前期（0～7 d）優勢細菌為Virgibacillus、Kroppenstedtia，發酵中期開始（14 d），優勢細菌演變為Lactobacillus。吳怡璇[32]對北方醬香第7輪次（第8次發酵）核心微生物進行鑒定。從中鑒定出優勢微生物為Issatchenkia、Thermomyces、Lactobacillus、彎孢霉菌屬（Cutaneotrichosporon）、Byssochlamys。這些核心微生物與主要揮發性物質（如正戊酸、異戊醇、乳酸乙酯）含量顯著正相關。與南方醬香（貴州地區）相比，棒狀桿菌屬（Corynebacillus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）為北方醬香型所特有優勢細菌屬，Cutaneotrichosporon、彎曲假絲酵母屬（Apiotrichum）、Issatchenkia、Kazachstania，為北方醬香所特有優勢真菌屬。

王歡[33]利用高通量測序技術對貴州茅臺鎮（南方醬香）第3，第4和第5輪次堆積發酵酒醅微生物進行解析，結果發現：微生物菌群多樣性隨發酵輪次的增加而增加；鑒定出Bacillus、Oceanobacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia為第3輪次酒醅優勢細菌屬為Oceanobacillus、Lentibacillus、Bacillus、Staphylococcus、Kroppenstedtia為第4輪次酒醅優勢細菌屬，Bacillus、Oceanobacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia為第5輪次酒醅優勢細菌屬；鑒定出Saccharomycopsis、Zygosaccharomyces為第3輪次酒醅優勢真菌屬，Saccharomyces、unclassified_f_Saccharomycetaceae為第4輪次酒醅優勢真菌屬，unclassified fSaccharomycetaceae、Monascus、Saccharomycopsis、Aspergillus為第5輪次酒醅優勢真菌屬。結果表明，第3，第4和第5輪次優勢真菌差別較大。

此外，龐澤敏等[9]比較南北方大曲微生物差異性，結果發現2個地區大曲優勢細菌均為Virgibacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Scopulibacillus，優勢真菌均為Thermoascus、Thermomyces、Aspergillus。高亦豹等[34]采用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳技術比較高溫大曲和中溫大曲細菌群落結構，從高溫大曲中鑒定出所特有的細菌物種Thermoactinomyces sanguinis。

4 機械設備對醬香型白酒釀造微生物多樣性的影響

蔣紅軍[35]比較傳統攤晾與機械攤晾場地微生物的差異，結果發現傳統攤晾場地細菌類微生物繁殖較快，種類較豐富、數量較多，而鋼板作為攤晾設備，由于水分蒸發較快，導致其表面細菌類微生物種類較單一，主要為芽孢菌，數量也較少。傳統攤晾場地酵母菌數量為機械攤晾設備的10～100倍，2種攤晾方式對霉菌數量影響不大，均以黃曲霉和根霉為主。

王歡等[36]比較機械化生產的醬香型白酒7輪次堆積發酵細菌群落特點，共檢測出14個門，456個屬的細菌。優勢細菌屬為Bacillus、Lactobacillus、Acinetobacter、Kroppenstedtia、Rhodococcus、Weissella、Oceanobacillus、Caulobacter、Lentibacillus、Sphingomonas、Thermoactinomyces、Pediococcus。Rhodococcus、Caulobacter被鑒定為機械化釀造過程中特有細菌屬。左乾程等[37]比較機械制曲與傳統制曲細菌群落演變規律，結果發現，機械制曲中細菌屬（84個）數量高于傳統制曲（82個），Pediococcus、Tepidimicrobium為機械制曲特有屬細菌。隨著發酵進行，細菌群落豐富性降低，逐漸演變為單一Firmicutes為主導的細菌群落。張瀚之等[38]對比機械化生產中不同輪次堆積發酵酒醅中真菌群落多樣性，Thermomyces、Thermoascus、Aspergillus、Torulaspora、Byssochlamys、Candida、Wickerhamomyces被鑒定為機械化生產中的特有真菌屬微生物。

5 結語與展望

近年來，醬香型白酒在中國白酒產業中異軍突起，成為白酒產業中的中堅力量。2021年醬香型白酒產能僅占白酒產能的8.4%，但營收和利潤卻高達31.5%和45.8%。微生物作為醬香型白酒生產的“生物工廠”，其對醬香型白酒品質的影響不言而喻。盡管對醬香型白酒釀造微生物的研究已取得一定進展，但仍存在一些問題亟待解決或深入研究。一是關鍵微生物種屬對酒體的貢獻度仍不清晰。一直以來，醬香型白酒主體香型物種未被鑒定出[39]，優勢微生物種屬對酒體香氣物質的貢獻度仍未被完全揭示清楚。二是不同種屬微生物間互作關系還有待進一步解析。白酒固態發酵是一個多菌種共同發酵體系，各類微生物之間相互影響、相互制約的關系還不明確。三是隨著交叉學科的快速發展和人口出生率的持續降低，白酒生產機械化和智能化轉型勢在必行，但機械化和智能化對醬香型白酒釀造微生物和酒體品質的影響還需要更多證據的支撐。四是新技術植入醬香型白酒生產和研究還需加強。組學技術的出現和飛速發展，也為醬香型白酒的生產和研究提供機遇，如風味組學、宏基因組學、脂質組學等技術在解析微生物種群多樣性、微生物種群間互作以及關鍵風味物質等方面具有無以比擬的優勢。因而多組學技術聯合生物信息學、分子生物學、生物統計學技術將會被越來越多地應用于解析醬香型白酒微生物種群多樣性研究中。五是功能微生物在醬香型白酒生產中的應用還比較少。解析醬香型白酒釀造微生物多樣性目的在于通過生產調控，強化功能微生物的作用，改善酒體品質。已有一些研究探索性地將某些種屬的微生物（如異常威克漢姆酵母[40-41]、乳酸菌[42]）應用于白酒生產，但還有更多種屬的微生物有待于應用于醬香型白酒的生產。