一種復合頭皮營養液對小鼠毛發生長的影響

吳旭升 孫廣 樂云辰

雄激素性脫發（androgeneticalopecia，AGA）是一種最常見的脫發類型，起始于青春期或青春后期，是一種進行性毛囊微小化的脫發疾病［1］。近年來，AGA 的發病率逐年上升，并且呈年輕化趨勢，給患者帶來極大困擾。AGA 的發病機制復雜，目前研究表明與遺傳、免疫紊亂、激素水平、雄激素受體的分布、局部微環境、細胞因子等相關［2］。由性激素代謝異常、毛囊微環境炎癥反應誘發毛囊微型化，被認為是AGA 發病的重要環節［3］。然而臨床治療選擇仍然有限和缺乏，米諾地爾是脫發非手術治療常用的外用藥物，其有效性已得到臨床的肯定，但也存在一定副作用［4］。吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物和二氨基嘧啶氧化物是兩種米諾地爾結構類似物，研究報道具有促進毛發生長的作用。因其良好的安全性，已經被批準用于個人頭皮洗護產品［5］。另外，雄激素水平增高，毛囊菌群失調，內源性應激等因素都可能會導致毛囊微炎癥。有研究顯示，菌群的失調可能是微炎癥的誘發因素［6］。因此，本研究在吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物和二氨基嘧啶氧化物的基礎上引入益生元和后生元等微生態組合物組成復合頭皮營養液，并通過動物實驗對其防脫生發功效進行評估，以及探討作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 3～4 周齡健康雄性C57BL/6J 小鼠，SPF級，體質量約16～18 g，上海靈暢生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（滬）2018-0003。由浙江鷹旸醫藥研發有限公司屏障系統內飼養，實驗飼養室許可證號：SYXK（浙）2021-0003。

1.2 主要試驗藥品與試劑 復合頭皮營養液（杭州鈦美生物科技有限公司，批號：2020051001，壹安態益生元頭皮營養液）；米諾地爾搽劑2%（山西振東安特生物制藥有限公司，批號：20210226）、米諾地爾搽劑5%（山西振東安特生物制藥有限公司，批號：20210712）；丙酸睪酮（麥克林，批號：C13133859）。

1.3 主要器材 NikonEclipseE100 正置光學顯微鏡，日本尼康；Micro17R 低溫高速離心，Thermo；YXQMG-202 脈動真空滅菌器，張家港華菱醫療設備股份公司；RM2016 病理切片機，上海徠卡儀器有限公司；CMaxPlus 酶標儀，MD；純水機、包埋機、染色機、組織攤平機等。

1.4 方法 取健康雄性C57BL/6J 小鼠，隨機分為5 組，分別為正常組、AGA 模型組、2%米諾地爾組、5%米諾地爾組和復合頭皮營養液組，每組各12 只。將小鼠后背約2 cm×3 cm 區進行脫毛處理。除正常組外，其余小鼠均皮下注射丙酸睪酮溶液5 mg/（kg·d），連續注射30 d 構建雄激素型脫發模型，每次注射1 h 后分別涂抹2%、5%米諾地爾和壹安態益生元頭皮營養液，1 mL/次，2 次/d，連續30 d；正常對照組及模型組均予外用生理鹽水。

1.5 觀察指標及測定 （1）小鼠背部毛發生長情況觀察及評分：觀察每個時間段各組小鼠背部在表皮顏色變化、皮膚過敏反應和毛發生長情況，拍照記錄并評分。毛發生長評分標準：0 分：未觀察到毛發生長；1 分：≤20%區域毛發生長；2 分：＞20%～40%區域毛發生長；3 分：＞40%～60%區域毛發生長；4 分：＞60%～80%區域毛發生長；5 分：＞80%區域毛發生長。（2）毛囊組織病理學觀察試驗：第30 天取背部給藥區域皮膚（面積約1 cm×1 cm），進行常規組織脫水，石蠟包埋，HE染色。通過顯微鏡進行毛囊組織形態學觀察并評分。見表1。

表1 組織病理學毛發生長評分標準

1.6 統計學方法 采用SPSS16.0 統計軟件。計量資料若符合正態分布且符合方差齊性檢驗，用One-way-ANOAY 單因素方差分析；若符合正態分布但方差不齊，則采用Dunnett’s T3 檢驗或獨立樣本t檢驗；若不符合正態分布，則采用Kruskal-WallisH檢驗。所有數據以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠毛發生長情況觀察結果 給予丙酸睪酮和實驗藥物試驗觀察期間，各組小鼠背部脫毛區，未見紅斑、水腫、水皰等皮膚刺激癥狀。第7 天，正常組小鼠背部毛發生長速度較快，已覆蓋大部分脫毛區；模型組小鼠見明顯毛發生長；各試驗組小鼠均可見不同程度新生毛發。第14 天，正常組小鼠背部毛發已覆蓋脫毛區；模型組小鼠有部分毛發生長；各試驗組小鼠新生毛發繼續增加。第30 天，正常組小鼠背部毛發已全部長好，烏黑有光澤，模型組小鼠還有部分區域未完全長好，各試驗組小鼠背部毛發已幾乎全部長好，毛發濃密。見圖1。對各組毛發生長進行評分，第7 天，第14 天，第30 天時，與正常組比較，模型組小鼠毛發生長評分顯著降低（P＜0.05）；第7 天，5%米諾地爾組毛發生長評分顯著高于2%米諾地爾組和復合頭皮營養液組；第14 天和第30 天，復合頭皮營養液組毛發生長評分均顯著高于2%米諾地爾組（P＜0.05），與5%米諾地爾組差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖1 小鼠毛發生長情況

圖2 小鼠毛發生長評分

2.2 皮膚毛囊組織形態學觀察及毛囊數目檢測 HE染色結果顯示：與正常組對比，模型組毛囊數明顯減少；與模型組對比，復合頭皮營養液組和5%米諾地爾組毛囊數量較多，分布比較密集，毛囊位于皮下組織深層；復合頭皮營養液組和5%米諾地爾組生長期增生狀態無顯著性差異，且優于2%米諾地爾組。見圖3。同時，通過對各組皮膚組織HE 半定量評分，對比模型組，2%米諾地爾組評分顯著下降（P＜0.05），復合頭皮營養液組和5%米諾地爾組評分顯著下降（P＜0.01）。見圖4。

圖4 小鼠HE評分

3 討論

局部用米諾地爾經FDA 批準用于男性和女性的雄激素性脫發，米諾地爾通過多種途徑發揮作用（血管擴張劑、抗炎劑、Wnt/b-連環蛋白信號通路的誘導劑、抗雄激素），還可能影響毛囊生長期和休止期的長度［7］。吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物和二氨基嘧啶氧化物是兩種米諾地爾結構類似物，分子結構中都含有二氨基嘧啶結構。研究顯示，該兩種化合物均體現了對人成纖維細胞中LHmRNA 表達的高抑制作用，抑制賴氨酰羥化酶的活性，與米諾地爾作用相當［8］。另外，一項多中心雙盲臨床研究，局部應用二氨基嘧啶氧化物對維持頭發密度有積極作用，并顯著抑制季節性脫發［9］。本研究中采用了含有吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物和二氨基嘧啶氧化物兩種結構類似物組合物的復合頭皮營養液，在雄激素型脫發小鼠實驗中同樣觀察到促進毛發生長的作用，與以往的研究結果一致，并且效果優于2%的米諾地爾，與5%的米諾地爾相當。研究結果提示該組合物可作為脫發患者非藥物治療方案的選擇。

目前越來越多的研究發現，皮膚微生物群與多種皮膚病相關。頭皮毛囊深入皮膚并攜帶不同于皮膚表面微生物群的復雜微生物群落。局部微生態失衡可能破壞皮膚的屏障功能，導致各種頭皮毛發疾病［10］。進一步研究提示，毛囊微環境炎癥反應誘發的毛囊微型化，而毛囊漏斗部的親脂性微生物可能是毛囊微炎癥的觸發因素［3］，而痤瘡丙酸桿菌和馬拉色菌是兩種皮膚常駐的親脂性優勢菌。一項研究證實，AGA 患者頭皮微生物中兩種親脂性的微生物豐度顯著高于正常人群［11］。免疫反應相關基因如Toll 樣受體2、β 防御素1、干擾素調節因子1、單核細胞表面標記CD14 和朗格漢斯細胞表面標記CD1a/CD207 在微小化毛囊中表達均增加［12］。同時與枕部頭皮和健康對照組比較，AGA 患者頭頂脫發區球形馬拉色菌和限制性馬拉色菌的豐度均增加［13］。這些研究均提示了頭皮菌群紊亂與AGA 可能有著潛在的聯系，而改善頭皮微生態環境的失衡可能是AGA 治療的基礎環節。這也為下一步實驗設計提供思路，對頭皮微生態環境在AGA 治療中的作用進行深入探討。

綜上所述，采用了含有兩種二氨基嘧啶氧化物衍生物和微生態調節成分的復合頭皮營養液，在雄激素型脫發小鼠中具有防脫生發作用，這種雙通路的機制也許是AGA 治療的一種新的策略。