基于TCGA數據庫分析MEAK7在非小細胞肺癌中的表達和臨床意義

徐凱麗 呂昕*

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在我國肺癌的發病人數和死亡人數均居惡性腫瘤首位［1-2］。目前肺癌預后預測主要依賴于組織病理學診斷和腫瘤分期系統，但這不足以準確評估預后［3］。TCGA 數據庫已被廣泛應用于科研工作。本研究利用數據庫中1,149 個非小細胞癌樣本的轉錄組測序數據構建Cox 比例風險回歸模型，可用于非小細胞肺癌預后風險評估［4］。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是PI3K 相關蛋白激酶家族中的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。mTOR 主要通過調節膜蛋白運輸、蛋白質降解、蛋白激酶C 信號以及核糖體合成等途徑，參與細胞生長與增殖的調控。其中，mTOR 可通過激活PI3K/AKT/mTOR 和AKT/TSC1-TSC2/mTOR 信號通路實現上述調節效應［5］。在包括非小細胞肺癌（NSCLC）在內的多種腫瘤中mTOR 呈激活狀態。有實驗數據顯示PI3K/AKT/mTOR 通路在NSCLC樣本中存在激活。通過免疫組化可見，NSCLC 切除組織中PI3K、AKT 和mTOR 的磷酸化水平較正常細胞顯著升高［6］。MEAK7 是mTOR 的相關蛋白，其可模擬雷帕霉素在人類細胞中的作用機制激活mTOR 信號傳導。作為mTOR 的必需互作蛋白，MEAK7 通過MTB 結構域與mTOR 結合，將信號傳導至溶酶體并參與mTOR 的溶酶體靶向募集［7］。然而MEAK7 在非小細胞肺癌腫瘤中的表達及其與NSCLC 患者生存關系研究鮮有報道［8］。

1 資料與方法

1.1 數據來源 從Genomic Data Commons（GDC）數據門戶網站（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫肺癌基因轉錄組數據及臨床數據，用Perl 軟件（5.32.1.1 版本）將數據進行整理并將轉錄組數據與臨床數據進行整合，最終收集肺鱗癌和肺腺癌的mRNA 表達譜和臨床數據1,149 例（包括肺腺癌598 例，肺鱗癌551 例）。

1.2 基因表達差異分析 MEAK7 的表達分組比較通過R 軟件包ggplot2（3.3.3 版本）進行實現，Wilcoxon 秩和檢驗分析結果顯示，P值＜0.05 被認為具有統計學意義。

1.3 生存分析 采用對數秩檢驗進行生存分析，臨界值設定在MEAK7 的中位表達水平。單變量和多變量Cox 回歸分析用于評估臨床變量對患者結局的影響。將單因素Cox 回歸分析中的預后變量P＜0.1 輸入到多變量Cox 回歸分析中。R 包ggplot2 用于可視化作圖。

1.4 列線圖的構建和驗證 為了預測總生存概率，在多變量Cox 分析中建立了基于獨立預后因素的列線圖。然后使用校準圖來評估列線圖的性能，并使用一致性指數（C 指數）來量化列線圖。列線圖和校準圖是使用R包RMS 創建的，使用timeROC 包執行隨時間變化的受試者工作特征（ROC）曲線以評估預測精度。

1.5 基因表達相關性分析 基因相關性圖通過R 軟件包ggplot2（3.3.3 版本）進行實現，使用Spearman 的相關分析來描述-正態分布的定量變量之間的相關性。分析數據中兩兩變量之間的相關性，并使用circlize 包對相關性結果進行可視化。

1.6 統計分析 所有統計分析均使用R（版本3.6.3）進行，采用Wilcoxon 秩和檢驗和配對樣本t檢驗分別評估MEAK7 在非配對和配對組織中表達的統計學意義。采用Wilcoxon 秩和檢驗和Logistic 回歸法評估臨床特征與MEAK7 表達之間的相關性。所有檢驗均為雙側檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 非小細胞肺癌患者臨床資料及MEAK7 表達的單因素及多因素Cox 分析 見表1。

表1 非小細胞肺癌患者臨床資料及MEAK7表達的單因素及多因素Cox分析

2.2 MEAK7 在腫瘤中表達情況 應用TIMER2 方法分析MEAK7 在TCGA 中的各種癌癥類型中的表達水平。MEAK7 在膀胱尿路上皮癌（BLCA）、膽管癌（CHOL）、結腸癌（COAD）、食管癌（ESCA）、頭頸鱗狀細胞癌（HNSC）、腎乳頭狀細胞癌（KIRP）、肝細胞肝癌、肺腺癌、肺鱗癌、前列腺癌（PRAD）、直腸腺癌（READ）、胃癌（STAD）等18 個腫瘤組織中的表達水平均高于相對應的正常組織（P＜0.05）（圖1A）。差異表達分析結果顯示，與正常癌旁組織相比，MEAK7 在肺非小細胞癌組織中明顯上調（P＜0.05）。配對差異分析結果表明，與相鄰正常的組織相比，肺癌組織中MEAK7 處于高表達。綜上，所有結果均顯示MEAK7 在腫瘤中的表達水平明顯高于正常組織，表明MEAK7 可能是影響肺癌預后的潛在關鍵基因（圖1B、1C）。作者又進一步通過ROC 曲線評估預測我們實驗的準確性，AUC 結果為0.815，進一步證明了實驗的準確性（圖1D）。

圖1 在不同類型腫瘤和肺癌中的MEAK7表達水平。A. 與TCGA和GTEx數據庫中的正常組織相比，MEAK7在不同類型的腫瘤中的表達；B. 在TCGA和GTEx數據庫的非小細胞肺癌和正常組織中；C. 在非小細胞肺癌和TCGA數據庫中的匹配正常組織；D. TCGA數據庫中非小細胞肺癌與正常組織分類的ROC曲線

2.3 基于臨床特征分析MEAK7 表達 通過對臨床樣本數據分析，在不同臨床表型的分布情況可以看出，肺癌中MEAK7 的高表達與分期、分級和年齡等臨床特征顯著相關。結果顯示，MEAK7 表達隨著T、M 分期進展而升高；同時與淋巴結浸潤相關；同時，MEAK7 表達與年齡正相關；吸煙患者的MEAK7 表達亦明顯高于不吸煙患者；男性患者的MEAK7 表達高于女性；同時在生存狀態的亞組間有顯著的差異。見圖2。

圖2 基于臨床特征分析MEAK7表達。注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

2.4 MEAK7 對肺癌患者的預后影響 利用風險模型結合臨床特征腫瘤TNM 分期、年齡、性別分級構建列線圖（圖3A）。校準曲線顯示，校正曲線接近理想曲線，表明列線圖模型預測結果與實際結果有較好的一致性（圖3B）。進一步通過ROC 曲線（1、3、5 年）評估預測實驗的準確性（圖3C）。在Kaplan-Meier 曲線分析的結果中均顯示，MEAK7 的高表達與患者的低OS、DSS 相關，且結果均具有統計學意義（圖3D、3E）。

圖3 MEAK7對肺癌患者的預后影響。A：利用風險模型結合臨床特征腫瘤TNM分期、年齡、性別分級構建列線圖；B：校準曲線表明列線圖模型預測結果與實際結果有較好的一致性；C：通過ROC曲線（1、3、5年）評估預測實驗的準確性；D、E：在Kaplan-Meier曲線分析基于OS、DSS相關，且結果均具有統計學意義（圖D、E）

2.5 MEAK7 相關結合蛋白的相互作用網絡 為了進一步研究MEAK7 基因在腫瘤發生中的分子機制，篩選出了MEAK7 的靶向結合蛋白和MEAK7 表達相關基因，最終獲得了20 個MEAK7 相關結合蛋白。見圖4。

圖4 MEAK7相關結合蛋白的相互作用網絡。A：20個MEAK7相關結合蛋白的相互作用網絡；B：MEAK7與這20個蛋白的共表達熱圖

3 討論

MEAK7 是mTOR 信號的陽性調節因子，在人類細胞中通過S6K2/4E-BP1 軸發揮作用［9］。MEAK7 在轉移性人類癌癥中顯著表達，并形成一種新的涉及DNAPK 的mTOR 復合物，以促進S6K2 信號傳導并抑制4EBP1。研究表明，mTOR 信號異常會導致神經系統疾病如進行性肌陣攣性癲癇、癌癥等多種疾病，因此更全面地了解mTOR 和MEAK7 的相互作用可能對預防或治療這些人類疾病很重要［10］。mTOR 是磷脂酰肌醇-3 激酶相關激酶（PIKK）家族的成員。能有效調節細胞代謝、DNA 修復途徑和基因組監測。mTOR 信號傳導由兩種多蛋白復合物定義［11］。溶酶體是mTOR 信號傳導的重要細胞區室。MEAK7 錨定在溶酶體膜上，并與DNA PK形成替代mTOR 復合物，以調節mTOR 信號［12］。

本研究基于TCGA 數據庫，初步探究了MEAK7 在NSCLC 患者中的預后和表達以及相關結合蛋白。初步結果表明，MEAK7 在NSCLC 中高表達；腫瘤分期越高，MEAK7 表達越高；高表達MEAK7 的NSCLC 患者總生存期低。作者也探索了與MEAK7 相關基因以及存在潛在相互作用的蛋白最終獲得了20 個與MEAK7 相關結合蛋白。本研究采用了多種生物信息學方法，處理了大量數據并進行分析，但目前的研究僅限于運用數據庫相關數據進行研究及驗證，接下去作者將展開MEAK7 在NSCLC 中的調節作用的基礎實驗等方面研究。