GGT5通過PI3K-MAPK通路調控胃癌細胞的增殖與遷移

楊帆帆 章浙忠 黃慧 許嘉 陳瑾 許健*

胃癌（Gastriccancer，GC）是世界范圍內常見的惡性腫瘤，其發病率和死亡率分別位居全球第5 位和第4位［1］。2020 年，全世界有100 多萬例胃癌新發病例和76.9 萬例死亡［2］。雖然病理學檢測是診斷胃癌的金標準，但具有一定的滯后性，同時實驗室缺乏針對早期胃癌特異性的生物學標志［3］。γ-谷氨酰轉移酶（Gammaglutamyltransferase，GGT）是一種多基因編碼的膜結合細胞外酶［4］，GGT1 和GGT5 是僅有的兩種裂解γ-谷氨酰鍵的細胞外酶［5］。GGT5 是迄今為止發現的唯一具有催化活性的GGT 酶，參與控制再氧化、藥物代謝、免疫功能［6］等機體功能。雖然GGT 是常規生化檢測項目，但有文獻表明GGT5 可能在胃癌的發生發展中發揮重要作用。本研究通過生物信息學分析［7］GGT5 在胃癌中的表達以及體外實驗檢測GGT5 敲低對胃癌細胞增殖遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 生物信息學分析 從UCSC 數據庫下載泛癌數據集：TCGAPan-cancer，提取每個樣本GGT5 基因表達數據，在Sangerbox 中分析GGT5 在不同腫瘤中的表達及其與預后、免疫浸潤、臨床分期的關系。從GEO 數據庫獲得GSE 數據集；利用LinkedOmic 數據庫研究GGT5 與GC 中其他基因的相關性。使用ClusterProfiler 對GGT5進行GO 功能分析并富集KEGG 通路，LinkedOmic 進行基因集富集分析。

1.2 臨床信息 選取浙江省中醫院近3 年診治的原發性胃癌患者124 例，納入標準為所有均行內鏡、剖腹或腹腔鏡手術切除患者，術前均未接受過任何胃癌治療者，無癲癇藥物服用史者，5 年內無其他惡性腫瘤者。選取近1年內進行健康體檢的287例人員作為健康對照組，納入標準為血脂無異常、腫瘤標志物正常、未診斷其他疾病者。收集胃癌患者術前和健康對照組的生化指標谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和谷氨酰轉肽酶（GGT），分析GGT 的差異（排除肝功能異常：ALT 男性為5～40 U/L，女性為5～35 U/L；AST8～40 U/L）。本研究遵循的程序符合浙江省中醫院倫理委員會批準。

1.3 細胞培養 HGC-27 和AGS 在10% 胎牛血清（Fetalbovineserum，FBS）的RPMI-1640 培養基中培養，MKN-45 在10%FBS 的DMEM 培養基中培養。細胞置于37℃、5%CO2的濕化培養箱中培養。

1.4 細胞轉染 該慢病毒載體具有綠色熒光蛋白（Greenfluorescentprotein，GFP）基因和嘌呤霉素抗性的特性。在6 孔板加入細胞至24 h 后融合至70%時，去除舊培養基，加入1 mL GGT5 敲降慢病毒（shGGT5，序列為GCTCTTCTTCAACGGGACAGA）懸液。同時用對照陰性慢病毒（shNC，序列為TTCTCCGAACGTGTCACGT）建立對照細胞系。當GFP 表達良好且生長穩定時，加入2μg/mL 嘌呤霉素選轉染不良的細胞。

1.5 RNA 提取和qPCR 檢測GGT5 敲降后表達水平 Trizol 法提取細胞總RNA 后逆轉錄成cDNA， 之后進行qPCR 檢測。 引物序列GAPDH：Forward5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'Reversed5'-TCCACCACCCTGTTGCTGT-3' ；GGT5 ：F5'-GTCAGCCTAGTCCTGCTGG-3'R5'-GGATGGCTCGTCCAATATCCG-3'。數據分析采用2-ΔΔCt方法。

1.6 CCK-8 檢測胃癌細胞的增殖 每孔3,000 個細胞接種至96 孔板中培養24 h、48 h、72 h 后每孔1 ∶10加入CCK-8 試劑，37℃孵育2 h 后，測定450 nm 處吸光度值。

1.7 EdU 檢測胃癌細胞的增殖 將5×105個細胞懸液注入6 孔板內待細胞培養過夜恢復正常狀態后進行EdU 實驗，熒光顯微鏡檢測增殖水平。

1.8 Transwell 和劃痕實驗觀察胃癌細胞的遷移 將5×104個細胞懸液注入1%FBS 培養基中饑餓培養24 h 后再次消化細胞，接種200 μL 2×104細胞懸液于Transwell 小室，置于24 孔板中10% FBS 培養基的下室培養24 h。在劃痕實驗中，將5×105細胞懸液接種至6 孔板中，24 h 后，用無菌的移液管尖端在單層細胞中劃痕。于0 h、24 h 時在6 孔板相同位置顯微鏡下觀察劃痕創面。

1.9 Western-blot 檢測蛋白表達 采用RIPA 裂解緩沖液提取細胞中的蛋白煮沸變性后經SDS-PAGE 凝膠電泳后轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫2 h 封閉，TBST 洗膜10 min 3 次，一抗4℃孵育過夜（表1）。次日使用對應二抗室溫孵育2 h，ECL 化學發光試劑顯影成像。

表1 一抗信息

1.10 統計分析 采用SPSS25.0 軟件、Graph Pad Prism8 進行統計分析和繪圖。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GGT5 在胃癌中的表達上調及其與臨床病理參數的關系 SPSS 分析結果顯示GGT 在胃癌患者中呈高表達（P＜0.05）（圖1A、表2）。TCGA 和GES 數據庫進一步證實作者的結果，GGT5 在胃癌組織中呈高表達（圖1B-G），GGT5 高表達的患者預后明顯較差（圖1H）。GGT5 在晚期腫瘤標本中表達明顯升高，且與胃癌的免疫浸潤呈正相關（圖2A-D）。數據庫分析顯示，GC 的發生與性別和年齡無關（圖2E-F）。差異表達分析得到806 個差異表達基因，802 個表達上調，4 個表達下調（圖2I）。EMILIN1、HIC1、C1R 和TMEM119 等基因與GGT5 呈正相關，LRPPRC、MELK、MAD2L1 和UCHL5等與GGT5 呈負相關（圖2G-H）。功能富集分析顯示，差異基因產物的分子功能主要與血管發育和血管生成的調節、細胞運動和遷移的調節、細胞外基質組織有關（圖2J-K）。

圖1 GGT5在胃癌中表達上調。A. 臨床胃癌患者血清GGT水平；B-F. GES數據庫胃癌組織中GGT5的表達；G. GGT5在TCGA數據庫胃癌組織中的表達；H. GGT5表達與預后的關系。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

圖2 GGT5在胃癌中的潛在功能。A-C. GGT5表達與臨床分期關系；D. GGT5與胃癌免疫浸潤的關系；E-F. 胃癌發生與性別年齡關系；G-H. 與GGT5呈正/負相關的顯著基因；I. 差異表達基因火山圖；J. GGT5的GESA功能富集分析；K. GGT5的KEGG通路分析和GO分析

表2 對胃癌患者和健康對照者的臨床資料進行統計分析

2.2 GGT5 低表達降低胃癌細胞的增殖能力 為明確GGT5 對胃癌的作用，首先熒光顯微鏡觀察轉染shNC和shGGT5 熒光效率達75%。qPCR 結果顯示，在GC 細胞中轉染shGGT5 后，GGT5 的表達明顯降低（圖3AB）。EdU 和CCK8 實驗檢測發現shGGT5 胃癌細胞的增殖能力受到抑制（圖3C-D）。

圖3 GGT5低表達降低胃癌細胞增殖。A. GFP轉染效率；B. qPCR檢測轉染效率；C. CCK8檢測細胞增殖；D. EdU檢測細胞增殖。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

2.3 GGT5 低表達下調PI3K/AKT-MAPK 信號通路抑制胃癌細胞增殖 與對照組相比，shGGT5 處理后P38 和ERK 的磷酸化水平明顯降低（P＜0.001），AKT、P-AKT、PI3KP85 和P-PI3KP85 蛋白表達降低（P＜0.001）。此外，GGT5 敲低后，核轉錄因子STAT5b 的表達被抑制（P＜0.001）（圖4）。結果表明，GGT5 的低表達可以通過調節PI3K/AKT-MAPK 信號通路影響胃癌的進展。

圖4 低水平GGT5表達通過下調PI3K/AKT-MAPK信號通路抑制胃癌細胞增殖。***P＜0.001

2.4 敲低GGT5 抑制胃癌細胞的遷移 劃痕實驗結果顯示，敲低GGT5 后胃癌細胞的遷移能力減弱（P＜0.001）。Transwell 檢測細胞遷移能力結果與劃痕實驗結果一致（P＜0.001）（圖5A-B）。Western-blot 結果顯示，當GGT5 被敲低時，MMP2（P＜0.01）、MMP9（P＜0.01）和EGFR（P＜0.01）的表達降低（圖5C）。

圖5 敲降GGT5抑制胃癌細胞的遷移。A. 劃痕實驗檢測細胞的遷移能力；B. Transwell驗證胃癌細胞的遷移能力；C. Western blot檢測MMPs通路。**P＜0.01，***P＜0.001

3 討論

早期胃癌可采用內鏡下黏膜切除或剝離術治療預后良好［8］。衛生條件的改善和幽門螺桿菌的消除使胃癌發生率降低［9］，但提高進展期和轉移性胃癌的生存率仍有較長的路要走［10］，且現有的胃癌生物標志物［11］敏感性和特異性均較低。因此尋找有效的治療靶點和新的生物標志物至關重要。

研究發現GGT5 在癌相關成纖維細胞中高表達，提示GGT5 可能是肺腺癌［12］合適的治療靶點。在本研究中，作者發現GGT 水平在GC 患者中較高。生物信息學發現GGT5 在胃癌中高表達，并與不良預后和臨床特征相關。作者進一步探索GGT5 在胃癌細胞中的作用機制，通過CCK8、EdU、劃痕和Transwell 實驗，發現GGT5低表達可以抑制胃癌細胞的生長和遷移，改變胃癌細胞的生物學特性。PI3K/AKT 信號通路可以促進細胞存活，被認為是腫瘤發生和癌癥進展的驅動因素，MAPKs也是調節腫瘤發展的重要通路［13］。與對照組相比，敲低GGT5 抑制了AKT、P-AKT、PI3KP85 和P-PI3KP85的表達，降低了磷酸化P38 和ERK 的表達。研究表明，MMPs 作為降解細胞外基質的重要酶，在介導腫瘤血管生成、轉移和侵襲中發揮重要作用。WesternBlot 顯示，敲低GGT5 后，MMP2、MMP9、EGFR 被抑制。因此，敲低GGT5 可以降低MMPs 的蛋白表達，抑制胃癌細胞的轉移。

GO 和KEGG 分析顯示GGT5 在調控血管生成、細胞運動和遷移、細胞外基質等相關過程顯著富集，表明GGT5 與胃癌的轉移和侵襲相關。EMILIN1、HIC1、C1R和TMEM119 與GGT5 呈正相關，與腫瘤的生長和不良預后有關［14-17］，LRPPRC、UCHL5、MAD2L1 和MELK與GGT5 負相關，可能是胃癌新的治療靶點［18-21］，因此GGT5 可能作為胃癌的預后生物標志物。