檢測棘球蚴病患者血清內(nèi)循環(huán)抗原的免疫層析試條的制備和評價

張 璟,王 穎,高春花,危芙蓉,賈孝凱,石 鋒

棘球蚴病又稱包蟲病,是由棘球絳蟲的幼蟲寄生所致的人獸共患的傳染性疾病。我國西部是世界上棘球蚴病患病率最高的地區(qū),主要流行兩種棘球蚴病,即細(xì)粒棘球蚴病(Cystic echinococcosis, CE,又稱囊型包蟲病)和多房棘球蚴病(Alveolar echinococcosis, AE,又稱泡型包蟲病)。包蟲病是當(dāng)前我國疾病負(fù)擔(dān)最嚴(yán)重的寄生蟲病[1-3],快速準(zhǔn)確的診斷方法對于棘球蚴病的有效控制具有重要意義。迄今,已有多種基于檢測循環(huán)抗體的棘球蚴病診斷產(chǎn)品問世并在實驗室和現(xiàn)場使用,但檢測循環(huán)抗體無法區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染,不利于病人的早期診斷和流行病控制策略的及時制定和實施[4-6]。有研究表明,棘球蚴純化包囊液粗抗原(Hydatid cyst fluid, HCF)檢測包蟲病的效能較高[7]。本研究制備了純化包囊液粗抗原的特異性單克隆抗體,研制了以雙抗夾心的抗原捕獲法為基礎(chǔ)的快速診斷包蟲病的膠體金免疫層析試條,并對其檢測效果進(jìn)行了評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器 1640培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司;新生小牛血清購自杭州四季青工程材料有限公司;HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG購自生工生物工程有限公司;小鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒購自洛陽佰奧通實驗材料中心;G蛋白層析柱購自美國Thermofisher公司;羊抗小鼠IgG購自英國Cohesion Bio公司;硝酸纖維素膜(CN140)、交聯(lián)釋放墊(8964)、吸水墊(H5072)和樣品墊(GRADE2)由上海杰一生物技術(shù)有限公司提供;氯金酸(HAuCl·Cl3·4H2O)(滬試牌)購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;XZ1000型噴膜機(jī)、CM4000型切條機(jī)為美國Bio-Dot公司產(chǎn)品。

1.2 血清樣品 確診棘球蚴病患者血清127份,其中細(xì)粒棘球蚴病患者血清87份,多房棘球蚴病患者血清40份,囊尾蚴病病人血清25份、日本血吸蟲病患者血清10份,弓形蟲病、并殖吸蟲病和華支睪吸蟲病患者血清各5份,健康人血清60份,由中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所(國家熱帶病研究中心)和新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心提供。本研究獲得中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所(國家熱帶病研究中心)倫理審查委員會批準(zhǔn),并取得受試者的知情同意。

1.3 純化HCF的制備 按參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。取新鮮羊肝包囊液,以1 000×g離心30 min除去沉淀,上清液裝入透析袋,對pH5.0的5 mmol/L乙酸緩沖液于4 ℃下透析;回收透析液50 000×g離心30 min,除去上清白蛋白;沉淀用pH8.0的200 mmol/L的PBS溶解,加飽和硫酸銨至40%,18 000×g離心30 min除去沉淀球蛋白,即得純化囊液粗抗原。

1.4 單克隆抗體的制備與初步分析

1.4.1 免疫 按文獻(xiàn)[9]方法,免疫BALB/c小鼠,每只首次腹腔注射250 μL(約100 μg)純化的囊液粗抗原與250 μL福氏完全佐劑的混懸液,之后第30 d、60 d各注射50 μg純化的囊液粗抗原與福氏不完全佐劑的混懸液1次,第90 d經(jīng)尾靜脈直接注射50 μg抗原加強(qiáng)免疫1次,第93 d取免疫小鼠的脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.4.2 雜交瘤細(xì)胞的產(chǎn)生與篩選 按本實驗室常規(guī)方法進(jìn)行SP2/0瘤細(xì)胞與免疫小鼠脾細(xì)胞的融合及雜交瘤細(xì)胞的克隆[9]。對雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行抗原ELISA檢測抗體分泌,收集對純化的囊液粗抗原反應(yīng)的克隆。

1.4.3 單克隆抗體(McAb)免疫球蛋白亞類鑒定 按照小鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒的說明書分別與羊抗鼠IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3進(jìn)行反應(yīng)以鑒定McAb免疫球蛋白亞類。

1.4.4 腹水制備與效價測定 將收集的雜交瘤細(xì)胞接種BALB/c小鼠,每只BALB/c小鼠腹腔注射5×106雜交瘤細(xì)胞,1周左右觀察小鼠的精神狀態(tài)和腹水量,并及時收取腹水,用常規(guī)ELISA法確定腹水效價。

1.5 單克隆抗體的配對和免疫層析試條的制備 采用G蛋白層析柱按其產(chǎn)品說明書純化單克隆抗體。參照文獻(xiàn)[10-11]用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金并用膠體金標(biāo)記單克隆抗體。純化的單克隆抗體分別作標(biāo)記抗體和包被抗體,與其他抗體進(jìn)行配對,篩選檢測敏感性和特異性均佳的抗體對用于制備試條。將篩選得到的單克隆抗體和羊抗鼠IgG分別噴涂在NC膜上適當(dāng)位置形成檢測線和質(zhì)控線制成試條。

1.6 免疫層析試條檢測條件的選取 將適量樣本血清加在樣品墊上,然后滴加適量樣本稀釋液,適時觀察并記錄檢測結(jié)果。

1.7 試條性能的評價 用制備的試條對上述包蟲病患者血清、其他寄生蟲病患者血清和健康者血清采取單盲法檢測。檢測結(jié)束后將試條檢測結(jié)果與病原學(xué)方法檢測結(jié)果進(jìn)行比較,統(tǒng)計試條檢測的敏感性和特異性。分別制備3批試條對同樣的血清進(jìn)行重復(fù)檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.0 軟件對試條檢測囊型和泡型包蟲病結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 羊棘球蚴囊液抗原的純化 將從我國新疆流行區(qū)收集的羊肝棘球蚴囊液離心后去除原頭節(jié),上清液經(jīng)透析和飽和硫酸銨沉淀后除去白蛋白和球蛋白,即得純化囊液粗抗原(圖1)。

注:M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量;1.純化前羊細(xì)粒棘球蚴囊液;2.純化中間產(chǎn)物;3.分離的雜蛋白;4.純化后的羊細(xì)粒棘球蚴囊液抗原

2.2 單克隆抗體的制備與初步鑒定 以純化羊細(xì)粒棘球蚴囊液免疫小鼠,取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0瘤細(xì)胞融合,經(jīng)篩選獲得11株高效分泌針對重組蛋白單克隆抗體的雜交瘤, 用雜交瘤培養(yǎng)上清對相應(yīng)的單克隆抗體的亞類進(jìn)行了鑒定(表1) ,將這些雜交瘤接種小鼠腹腔均獲得了含高效價單克隆抗體的腹水(表1) 。

表1 單克隆抗體特性

2.3 單克隆抗體配對和試條的制備 制備的11株單克隆抗體分別作為包被抗體和標(biāo)記抗體進(jìn)行配對實驗, 經(jīng)比較選擇單克隆抗體F3B6標(biāo)記膠體金作為檢測抗體, 選擇C4H6作包被抗體, 檢測效果最佳。檢測線上的C4H6單克隆抗體工作濃度為1.2 mg/mL,噴涂量為1 μL/cm;質(zhì)控線羊抗鼠IgG工作濃度為1.0 mg/mL,噴涂量為1 μL/cm;膠體金標(biāo)記探針F3B6單克隆抗體的工作濃度(以蛋白濃度計):20 μg/mL,噴涂量為40 μL/cm。

2.4 試條的檢測條件 每次檢測取5 μL血清,滴加在試條底部樣品墊上,再緩慢滴加3滴(120～200 μL)樣本稀釋液。檢測線和質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶,不論強(qiáng)弱即判為陽性;若僅有質(zhì)控線顯色判為陰性(圖2)。檢測結(jié)果均在15 min 內(nèi)判斷。

注:1-10.陽性樣本檢測結(jié)果;11-20.陰性樣本檢測結(jié)果

2.5 試條法檢測結(jié)果 分別用3批制備的試條對包蟲病患者血清、其他寄生蟲病患者血清和健康者血清進(jìn)行檢測,批次間檢測結(jié)果完全符合。用研制的試條檢測127份棘球蚴病患者血清的敏感性為88.12%(112/127),其中試條檢測囊型包蟲病患者血清的敏感性為88.51%(77/87),檢測泡型包蟲病患者血清的敏感性為87.5%(35/40),試條法檢測兩型包蟲病患者血清敏感性之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.03,P=0.86)。與25份囊尾蚴病患者血清、10份日本血吸蟲病患者血清、5份弓形蟲病患者血清、5份并殖吸蟲病患者血清和5份華支睪吸蟲病患者血清均無交叉反應(yīng),60份健康者血清也均為陰性,總特異性為100.00%(表2)。

表2 試條法檢測寄生蟲病患者和健康人血清

3 討 論

目前,對包蟲病的診斷主要依賴影像學(xué)方法[12],由于該方法不能進(jìn)行早期診斷,易造成患者錯過最佳藥物治療期,同時該方法需要使用儀器,對技術(shù)要求高,不適合于大規(guī)模防治的需要。免疫學(xué)診斷方法具有敏感特異的特點,目前應(yīng)用的檢測包蟲病方法均基于檢測特異抗體,其檢測效能極大地依賴所應(yīng)用的抗原。本課題組用ELISA方法評價了細(xì)粒棘球蚴純化囊液粗抗原、天然抗原B(nAgB)及其3個重組亞基(rAgB8/1、rAgB8/2和rAgB8/3)檢測囊型包蟲病的效能,結(jié)果顯示天然抗原應(yīng)用ELISA法檢測囊型包蟲病的效能總體優(yōu)于重組抗原[7],并以細(xì)粒棘球蚴包囊液純化抗原(檢測CE)和EM18重組蛋白(檢測AE)分別作為包被抗原,以抗IgG抗體標(biāo)記膠體金作為檢測試劑,研制出了能夠區(qū)分檢測兩型包蟲病特異抗體的免疫層析試條。該試條檢測包蟲病的敏感性和特異性均達(dá)到90%以上[6,13],但囊液抗原存在不易標(biāo)準(zhǔn)化,與其他寄生蟲病患者血清存在不同程度的交叉反應(yīng)的問題[7]。另外,由于抗體在包蟲病患者治療后仍可長時間存在,不能區(qū)分既往感染和當(dāng)前感染,而檢測宿主體液中的循環(huán)抗原則可準(zhǔn)確地判斷宿主體內(nèi)有無棘球蚴存在,為確定原發(fā)、繼發(fā)、再感染及療效考核提供依據(jù)。已有不同作者應(yīng)用單克隆抗體夾心ELISA[14]、dot-ELISA[15]和免疫金銀法[16]檢測棘球蚴病患者血清中的循環(huán)抗原的報道,但由于循環(huán)抗原在血清中含量甚微和檢測方法的限制,陽性率低,不適合現(xiàn)場應(yīng)用。

本研究制備棘球蚴囊液純化抗原特異性單克隆抗體,以此單克隆抗體為基礎(chǔ)研制的膠體金免疫層析試條,用以檢測人棘球蚴病血清中的循環(huán)抗原敏感性為88.51%(77/87),檢測其他寄生蟲病患者血清和健康人血清也表現(xiàn)出很好的特異性,高達(dá)100%,檢測囊型包蟲病和泡型包蟲病患者血清敏感性之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.03,P=0.86)。該試條具有操作快速、簡便,無需任何儀器和設(shè)備;性能穩(wěn)定,重復(fù)性好,結(jié)果判斷客觀,樣品無需冷藏等優(yōu)點,特別適合現(xiàn)場應(yīng)用。

本研究篩選到的單克隆抗體F3B6和C4H6對囊型包蟲病和泡型包蟲病患者血清均有反應(yīng),以此制備的試條不能區(qū)分兩型包蟲病。進(jìn)一步篩選出針對細(xì)粒棘球蚴或多房棘球蚴抗原的特異性單克隆抗體,以此制備可區(qū)分檢測囊型包蟲病和泡型包蟲病患者血清循環(huán)抗原的膠體金免疫層析試條是今后的研究方向。

利益沖突：無

引用本文格式：張璟,王穎,高春花,等.檢測棘球蚴病患者血清內(nèi)循環(huán)抗原的免疫層析試條的制備和評價[J].中國人獸共患病學(xué)報,2024,40(2):166-170. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.021