基于高通量測序技術(shù)探討益糖康對糖尿病小鼠外周血miRNA表達(dá)譜的影響*

劉妍鑠,郭雋馥,楊宇峰,石巖

遼寧中醫(yī)藥大學(xué),遼寧 沈陽 110847

糖尿病是一種以慢性高血糖為主要特征的內(nèi)分泌代謝性疾病[1]。國際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,2021年全球20～79歲糖尿病患者占總?cè)丝跀?shù)的10.5%,預(yù)計2045年這一比例將增至12.2%[2]。糖尿病及其并發(fā)癥的防治已成為全球醫(yī)學(xué)界面臨的重大挑戰(zhàn)。石巖教授倡導(dǎo)“脾虛致消”理論,以“健脾益氣、養(yǎng)陰清熱活血”為治則,在降糖丹的基礎(chǔ)上形成中藥復(fù)方益糖康。大量實驗研究表明,益糖康治療糖尿病的作用機(jī)制主要與改善糖脂代謝紊亂[3-4]、改善胰島素抵抗[5-6]、抑制糖異生[7]、抑制氧化應(yīng)激[8]、抑制炎癥反應(yīng)[9-10],以及調(diào)節(jié)胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)分泌[11]等有關(guān)。

近年來,miRNA在多種重大疾病發(fā)生發(fā)展中的重要作用及其作為潛在藥物靶點的研究已成為熱點。研究顯示,miRNA可通過干預(yù)胰島β細(xì)胞功能[12-13]、調(diào)節(jié)胰島素的合成與分泌[14-15]、調(diào)控胰島素信號傳導(dǎo)[16]等途徑影響糖代謝,進(jìn)而直接或間接參與糖尿病的發(fā)生與發(fā)展。目前,尚無益糖康調(diào)控miRNA的研究報道。因此,本研究采用高通量測序技術(shù)分析益糖康對糖尿病小鼠外周血miRNA表達(dá)譜的影響,預(yù)測其潛在靶基因,以期從miRNA的角度探索益糖康防治糖尿病的作用機(jī)制,為其臨床推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級C57BL/6雄性小鼠15只,6～8周齡,體質(zhì)量(20±2)g,購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,質(zhì)量合格證編號:2107262111-01612071。小鼠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心,溫度18～25 ℃,濕度60%～70%,12 h/12 h明暗交替,自由進(jìn)食和飲水。實驗方案經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理審查委員會審核批準(zhǔn),倫理審查編號:210000420200073。

1.2 藥物與試劑益糖康(中藥飲片由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥局提供);RNA提取試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司,貨號:RE-0101T);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購自美國Bimake生物科技有限公司。

1.3 儀器全自動生化分析儀(深圳雷杜生命科學(xué)有限公司);羅氏活力血糖儀(德國Roche Diagnostics公司);-80 ℃低溫冰箱(日本Sanyo公司)。

2 方法

2.1 藥物制備益糖康中藥飲片浸泡30～60 min,煎煮3次,過濾,去除藥渣;將3次水煎液混合,濃縮至生藥質(zhì)量濃度3.22 g·mL-1,冷藏備用。采用pH 4.2的檸檬酸鹽緩沖液(0.1 mol·L-1)配制鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),質(zhì)量濃度為3.0 g·L-1,現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2 動物分組、造模及給藥適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d后,將15只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白組5只、造模組10只,前者給予普通飼料,后者給予高脂飼料;喂養(yǎng)4周后,禁食12 h,造模組小鼠腹腔注射STZ(100 mg·kg-1),空白組小鼠腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液;造模組小鼠繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)7 d,禁食12 h后測定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),高于11.1 mmol·L-1視為糖尿病模型建立成功。將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組和益糖康組,每組5只,繼續(xù)給予高脂飼料。益糖康組小鼠的灌胃劑量為32.2 g·kg-1,空白組和模型組小鼠的灌胃劑量為10 mL·kg-1,連續(xù)9周,每日1次。

2.3 外周血樣本制備小鼠禁食12 h,1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉,摘除眼球取全血,置于-80 ℃ 冰箱保存。

2.4 FBG測定給藥前及第1—9周,末次給藥后,取小鼠尾尖血,將其滴于羅氏血糖儀配套血糖試紙上,測定并記錄FBG。

2.5 高通量測序技術(shù)檢測外周血miRNA表達(dá)情況模型組和益糖康組分別隨機(jī)選取3份外周血樣本進(jìn)行miRNA測序和分析。每個樣本取1 μg總RNA在3′端和5′端進(jìn)行接頭連接,然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增;構(gòu)建miRNA文庫并進(jìn)行質(zhì)量控制檢測,確保插入物的平均大小為140～150 bp;以Illumina HiSeq為基礎(chǔ),采用高通量測序技術(shù)進(jìn)行全基因組測序。利用DESeq v1.18.0(Anders和Huber,2010)對不同樣本中的miRNA表達(dá)量進(jìn)行比較,以|log2Fold Change|>1,P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)miRNA。

2.6 基因本體(Gene Ontology,GO)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析以模型組和益糖康組小鼠mRNA的3′ UTR序列為目標(biāo)序列,通過miRanda數(shù)據(jù)庫預(yù)測差異表達(dá)miRNA的靶基因。通過GO數(shù)據(jù)庫(http://geneontology.org/)預(yù)測靶基因涉及的細(xì)胞組成(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)、生物進(jìn)程(biological proccess,BP),具體方法為:根據(jù)每個條目中的靶基因數(shù)目,采用超幾何分布(P<0.05)的方法,計算靶基因在全基因組中的相對豐度,進(jìn)而識別靶基因所發(fā)揮的重要功能。將靶基因上傳至KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.kegg.jp/)進(jìn)行通路富集分析,結(jié)果根據(jù)FDR值升序排序。

3 結(jié)果

3.1 益糖康對糖尿病小鼠FBG的影響給藥前,模型組小鼠FBG>11.1 mmol·L-1,提示糖尿病模型建立成功。給藥第1—9周,與空白組比較,模型組小鼠FBG升高(P<0.01);給藥第4—9周,與模型組比較,益糖康組小鼠FBG降低(P<0.05,P<0.01),見圖1。

注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3.2 益糖康對糖尿病小鼠外周血miRNA表達(dá)的影響采用高通量測序技術(shù)檢測模型組和益糖康組小鼠外周血miRNA表達(dá)量,結(jié)果顯示,與模型組比較,益糖康組小鼠外周血中8個miRNA表達(dá)上調(diào),包括miR-434-3p、miR-187-3p、miR-1895等;5個miRNA表達(dá)下調(diào),包括miR-150-5p、miR-6912-5p、miR-342-5p等。這些差異表達(dá)miRNA的主要功能包括細(xì)胞分化、肌肉發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激、糖脂代謝、炎癥等,見表1、圖2。

表1 模型組與益糖康組小鼠差異表達(dá)miRNA信息

圖2 模型組與益糖康組小鼠外周血差異表達(dá)miRNA熱圖

3.3 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析通過miRanda數(shù)據(jù)庫預(yù)測13個差異表達(dá)miRNA的靶基因,并對靶基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO分析結(jié)果顯示,CC主要涉及細(xì)胞、細(xì)胞解剖實體、細(xì)胞連接與融合、突觸、細(xì)胞質(zhì)(膜)的組成成分和內(nèi)在成分等;MF主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、激酶結(jié)合、離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性等;BP主要涉及生物調(diào)控、細(xì)胞過程調(diào)控、細(xì)胞交流、細(xì)胞對刺激的反應(yīng)等,排名前10位的條目見圖3。KEGG分析結(jié)果顯示,主要通路包括絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路、Ras信號通路、叉頭框蛋白O(forkhead box protein O,FoxO)信號通路、受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine-protein kinase,ErbB)信號通路、細(xì)胞內(nèi)吞、細(xì)胞衰老、細(xì)胞分化、胰島素抵抗、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體(advanced glycation end product-receptor,AGE-RAGE)信號通路等,排名前20位的通路見圖4。

圖3 GO功能分析柱狀圖

圖4 KEGG通路分析氣泡圖

4 討論

糖尿病是一種由胰島素分泌絕對或相對不足,從而導(dǎo)致糖、脂肪、蛋白質(zhì)等代謝失調(diào)為特點的內(nèi)分泌代謝疾病。中醫(yī)學(xué)將糖尿病歸屬于“消渴”范疇,其病機(jī)以陰虛為本、燥熱為標(biāo)。陰津虧損會導(dǎo)致燥熱偏盛,兩者互為因果,陰愈虛則燥熱愈盛,燥熱愈盛則陰更虛。石巖教授經(jīng)過長期臨床實踐創(chuàng)制中藥復(fù)方益糖康,該方由黃芪、白術(shù)、黃連、黃精、丹參等14味中藥組成[32],具有降糖降脂作用,臨床用于防治糖尿病及其并發(fā)癥療效顯著。

miRNA是一組長21～23個核苷酸,在真核生物中普遍分布的非編碼微小RNA[33]。miRNA在生物體內(nèi)廣泛分布,并且在進(jìn)化上具有很強(qiáng)的保守性。他們參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤生長及轉(zhuǎn)移等生理病理過程[31]。由于外周血中的 miRNA在較高溫度下具有較強(qiáng)的耐受性,因而被認(rèn)為是潛在的疾病早期診斷標(biāo)志物[34]。miRNA在血液中分布廣泛,由于其穩(wěn)定性及可選擇性釋放,已被證實與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此,分析外周血miRNA,研究其靶向分子和相關(guān)信號傳導(dǎo)途徑有利于糖尿病等代謝性疾病的精準(zhǔn)靶向防治。

本研究通過miRNA-Seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)13個可能介導(dǎo)益糖康發(fā)揮作用的miRNA,主要是益糖康干預(yù)后表達(dá)上調(diào)的miR-434-3p、miR-382-3p等8個miRNA以及表達(dá)下調(diào)的miR-342-5p、miR-150-5p等5個miRNA。文獻(xiàn)報道顯示,過表達(dá)miR-434-3p通過靶向GATA結(jié)合蛋白4(GATA binding protein-4,GATA-4)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[17]。王立俠等[27]研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-150-5p可促進(jìn)細(xì)胞存活,抑制乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放和細(xì)胞凋亡,從而減輕氧-糖剝奪(oxygen glucose deprivation,OGD)誘導(dǎo)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷。此外,α-硫辛酸輔助奧美沙坦酯治療糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)的機(jī)制可能與降低血清miR-150-5p、miR-155-5p表達(dá)水平,進(jìn)而改善患者血糖水平、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[28]。2型糖尿病患者血清miR-342-5p水平可反映其脂質(zhì)代謝異常程度[29]。百日咳桿菌引起的炎癥反應(yīng)可使血清miR-342-5p表達(dá)顯著上升,這表明miR-342-5p可能參與炎癥的發(fā)生發(fā)展過程[31]。由此說明,益糖康調(diào)控miRNA可能與糖脂代謝、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化及細(xì)胞損傷等作用密切相關(guān),但其潛在機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

既往研究表明,眾多信號傳導(dǎo)途徑與糖尿病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。磷酸酯酶D (phospholipase D,PLD)是一種重要的細(xì)胞內(nèi)受體,參與調(diào)控Ⅰ型肌纖維中由胰島素刺激或肌肉收縮觸發(fā)的肌細(xì)胞葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)[35]。糖腎平膠囊能夠調(diào)節(jié)DN腎組織中TGF-β1/p38 MAPK信號,降低包括足細(xì)胞在內(nèi)的腎內(nèi)在細(xì)胞凋亡,減輕腎臟病變,從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用并延緩病程進(jìn)展[36]。MAPK信號通路參與高糖誘導(dǎo)的糖尿病多臟器病變的發(fā)生與發(fā)展,但其具體作用機(jī)制尚不明確。KEGG通路富集結(jié)果顯示,差異表達(dá)miRNA的靶基因可能在PLD、MAPK、TGF-β、Ras、FoxO、ErbB、胰島素抵抗、AGE-RAGE等信號通路中呈現(xiàn)高表達(dá),推測益糖康可能通過調(diào)控上述通路治療糖尿病。

綜上所述,益糖康治療小鼠糖尿病的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)外周血miRNA表達(dá),影響細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、糖脂代謝等功能,調(diào)控FoxO信號通路、胰島素抵抗等通路有關(guān)。本研究為中醫(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)癥的病理、藥理機(jī)制研究提供新的思路和方向。