黑色素瘤SENP1蛋白質(zhì)參與達(dá)卡巴嗪耐藥性的探究

趙 蓓 施小琪 唐雪梅 程 石*

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院(電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院)皮膚科(皮膚病性病研究所),成都 610000;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,成都 610000)

黑色素瘤是一種由黑色素細(xì)胞惡性病變導(dǎo)致的皮膚癌癥,并且已經(jīng)成為男性癌癥發(fā)病率增長(zhǎng)最快及女性發(fā)病率增長(zhǎng)第二快的癌癥[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),2020年全球范圍內(nèi)新增皮膚黑色素瘤患者324 635例,其中死亡57 043例[2]。如在發(fā)病早期完成診斷,大多數(shù)黑色素瘤是可以治愈的。而一旦黑色素瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移,則預(yù)后較差,死亡病例甚至占到皮膚癌導(dǎo)致的死亡病例的80%以上[3]。晚期患者中位生存期僅為7.5個(gè)月,2年生存率約為15%,5年生存率僅為5%[4]。

針對(duì)早期皮膚黑色素瘤,外科手術(shù)是主要的治療手段,但是對(duì)于中晚期黑色素瘤患者,化學(xué)藥物治療(以下簡(jiǎn)稱化療)等輔助治療或姑息性治療是改善預(yù)后的重要手段。其中,達(dá)卡巴嗪(dacarbazine,DTIC)是經(jīng)美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)的治療晚期黑色素瘤的常規(guī)化療藥物[5]。即便如此,由于內(nèi)在抗性或細(xì)胞抑制藥物導(dǎo)致黑色素瘤的耐藥性,目前化療效果不佳。耐藥性是限制化療治療惡性黑色素瘤療效的主要問題;如果能夠減少耐藥,患者生存率可能提高。因此,研究黑色素瘤的耐藥機(jī)制成為解決問題的關(guān)鍵。

Huang：Think carefully.Xi’er will have a happy life.

為進(jìn)一步發(fā)掘與黑色素瘤耐藥性相關(guān)的基因及信號(hào)通路,闡明其耐藥機(jī)制,本研究以A375、M14黑色素瘤細(xì)胞為研究對(duì)象,通過逐漸提高DTIC濃度獲得耐藥性黑色素瘤細(xì)胞株[6],隨后通過轉(zhuǎn)錄物組學(xué),分析黑色素瘤細(xì)胞出發(fā)株及耐受株,獲得發(fā)生顯著差異表達(dá)的類泛素特異性蛋白酶1(SUMO-specific protease 1,SENP1)基因及信號(hào)通路,最后通過對(duì)相關(guān)基因的過表達(dá)及抑制,發(fā)現(xiàn)了其與黑色素瘤耐藥性的相關(guān)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器

1.1.1 細(xì)胞株

本實(shí)驗(yàn)使用A375、M14細(xì)胞株,由四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室自行保存。

1.1.3 儀器

以A375、M14黑色素瘤細(xì)胞為對(duì)象,從初始誘導(dǎo)劑量2 μg/mL的DTIC處理處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375、M14細(xì)胞培養(yǎng)24 h后換培養(yǎng)液,待其長(zhǎng)至70%～80%密度時(shí),再次加入2 μg/mL DTIC,同時(shí)開始成倍增加藥物誘導(dǎo)劑量,每個(gè)劑量培養(yǎng)10 d。出發(fā)細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組(A375-WT及M14-WT),最終獲得的耐藥性細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組(DTIC-resistant,DR)。

1.1.2 試劑

第一，外校考入本校研究生在本科階段只學(xué)習(xí)了工程熱力學(xué)和傳熱學(xué)等基本課程，缺乏對(duì)燃?xì)廨啓C(jī)專業(yè)知識(shí)的學(xué)習(xí)，導(dǎo)致入學(xué)之后學(xué)習(xí)我校研究生課程存在一定的困難，在課程結(jié)束之后也很難進(jìn)入研究課題。第二，研究生入學(xué)后，以導(dǎo)師研究方向選擇相應(yīng)的課程和開展相關(guān)課題研究，學(xué)生畢業(yè)之后只熟悉自己的研究領(lǐng)域，不了解燃?xì)廨啓C(jī)其他研究方向的內(nèi)容。燃?xì)廨啓C(jī)的設(shè)計(jì)是一個(gè)團(tuán)隊(duì)協(xié)作的工作，因此很難有效開展研究。第三，缺乏系統(tǒng)深入的了解，燃?xì)廨啓C(jī)整體性能知識(shí)儲(chǔ)備不足，不能滿足研究生階段及其參加工作后對(duì)于燃?xì)廨啓C(jī)系統(tǒng)分析的需要。

在對(duì)A375及M14黑色素瘤細(xì)胞株連續(xù)添加DTIC培養(yǎng)(詳見方法部分)8個(gè)月后,本研究對(duì)兩株實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞(DR)與出發(fā)株(對(duì)照組,WT)的耐受性進(jìn)行了比較。首先,本研究測(cè)定了各細(xì)胞株對(duì)DTIC的半抑制濃度(the half maximal inhibitory concentration,IC50)。如圖1A所示,經(jīng)過8個(gè)月的處理后,無論A375還是M14黑色素瘤細(xì)胞株,其對(duì)DTIC的耐受能力都顯著增加。其中,A375耐受株(A375-DR)相比對(duì)照組(A375-WT),IC50從(22.5±2.1)μmol/L提升至(138.4±1.7)μmol/L(P<0.001);而M14耐受株(M14-DR)相比對(duì)照組(M14-WT),IC50從(27.3±2.3)μmol/L提升至(167.4±2.2)μmol/L(P<0.001)。隨后,本研究測(cè)定了耐受株與對(duì)照組在DTIC處理下的細(xì)胞凋亡情況。如圖1B及1C所示,在10 μg/mL DTIC處理48 h后,A375-DR相比A375-WT以及M14-DR相比M14-WT,活細(xì)胞數(shù)量明顯增加而凋亡細(xì)胞量均明顯減少。以上結(jié)果表明,本研究成功獲得了耐受DTIC的黑色素瘤細(xì)胞,同時(shí)也表明DTIC的長(zhǎng)期使用可使得黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。

本研究所建立的青皮藥材的HPLC指紋圖譜，可反映藥材樣品的特異性和整體性信息。在11個(gè)共有峰中，通過與對(duì)照品HPLC圖譜比對(duì)指認(rèn)出了橙皮苷峰。10批藥材樣品的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，各批藥材樣品間質(zhì)量存在差異。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD差異小，但相對(duì)峰面積的RSD相差較大，提示不同產(chǎn)地藥材樣品的成分雖一致，但含量差異較大，這可能與藥材的生長(zhǎng)環(huán)境、采收季節(jié)、加工炮制等因素有關(guān)。

1.2 方法

采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。將對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞接種于24孔板(5×104個(gè)細(xì)胞/孔),分組培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞(1 000 r/min離心5 min),磷酸鹽緩沖液洗1次后加入100 μL Annevix Binding Buffer重懸,依次加入5 μL Annevix FITC及5μL PI,室溫避光15 min。上機(jī)前補(bǔ)加150 μL Annevix Binding Buffer后進(jìn)行凋亡檢測(cè)。

本研究所用主要試劑包括:DTIC(D129847,阿拉丁,中國)、Annexin V-APC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(HR8284,百奧萊博,中國)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,D8371,索萊寶,中國)、脫脂奶粉(D8340,索萊寶,中國)、Tris-HCl-NaCl-Tween(TBST)緩沖液(T1081,索萊寶,中國)、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS)(P1022,索萊寶,中國)、放射免疫沉淀試驗(yàn)緩沖液(radio immunoprecipitation assay buffer,RIPA)(R0020,索萊寶,中國)、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(M128783,阿拉丁,中國)、四甲基乙二胺(TEMED,T105496,阿拉丁,中國)、過硫酸銨(A112450,阿拉丁,中國)、考馬斯亮藍(lán)(B104241,阿拉丁,中國)、SYBR qPCR Master Mix(Q711,諾唯贊,中國)。

1.2.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

1.2.1 黑色素瘤耐藥細(xì)胞株的構(gòu)建

國有農(nóng)場(chǎng)辦社會(huì)職能改革和農(nóng)墾國有土地使用權(quán)確權(quán)登記發(fā)證任務(wù)基本完成。全國35個(gè)墾區(qū)中，21個(gè)墾區(qū)已全面完成國有農(nóng)場(chǎng)辦社會(huì)職能改革。全國農(nóng)墾國有農(nóng)場(chǎng)中已完成辦社會(huì)職能改革任務(wù)的超過80%。公檢法、基礎(chǔ)教育機(jī)構(gòu)、基本醫(yī)療和公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)等三項(xiàng)改革任務(wù)已基本完成。農(nóng)墾國有土地確權(quán)率、發(fā)證率基本達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄物組學(xué)分析

將成功建立的黑色素瘤野生型和耐藥型細(xì)胞株用4℃預(yù)冷的1×PBS漂洗細(xì)胞2～3遍,加入Trizol。將樣本送公司進(jìn)行RNA測(cè)序(華大基因,中國)。將結(jié)果進(jìn)行兩組間基因表達(dá)水平分析、新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)、GO/KEGG富集分析、蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析、基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,從而得到耐藥后黑色素瘤RNA轉(zhuǎn)錄水平變化的結(jié)果。用Trizol(Invitrogen)從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中分離總RNA。cDNA文庫使用BGISEQ-500平臺(tái)(華大基因,深圳,中國)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。使FastQC(版本0.11.8)檢查原始測(cè)序讀數(shù)。通過Cutadapt(v2.0)對(duì)適配器修剪和低質(zhì)量濾波進(jìn)行分析,得到干凈的數(shù)據(jù)。采用featurets(v1.6.0)軟件對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行量化,采用DESeq2(R版本3.3.2)軟件創(chuàng)建處理組間差異表達(dá)基因。采用折次變化臨界值≥1.5,調(diào)整P值≤0.05。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)分析

古人有詩云：“綠蟻新醅酒，紅泥小火爐，晚來天欲雪，能飲一杯無？”嚴(yán)寒冬日的晚上，無論是約三五好友，還是獨(dú)自一人，守著熱氣騰騰的火鍋，喝兩杯小酒，那都是一件心曠神怡的事情。不過，吃火鍋可絕對(duì)不是中國人的專利，在外國許多地方也是有火鍋的，而且五花八門，各具特色，非常有意思。

在黑色素瘤細(xì)胞裂解液中,加入YAP蛋白質(zhì)單克隆抗體,混旋儀4 ℃孵育過夜,加入適量PierceTMProteinA/G Magnetic Beads,置于4 ℃混合儀,旋轉(zhuǎn)孵育2～4 h。將離心管置于磁力架上,靜止1～2 min,待所有磁珠吸附于磁力架上,棄上清。加入4 ℃預(yù)冷的NP-40蛋白裂解液去除磁珠上未結(jié)合的蛋白質(zhì),棄上清。加入100 μL 1×loading buffer重懸管中的磁珠。混勻,煮沸10 min,冷卻。將離心管置于磁力架上,靜止1～2 min,待所有磁珠吸附于磁力架上,取上清進(jìn)行WB,SUMO一抗孵育全膜,檢測(cè)SUMO化修飾。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting,WB)

采用WB檢測(cè)不同處理因素對(duì)A375細(xì)胞蛋白質(zhì)水平的影響。收集不同處理因素的細(xì)胞,使用RIPA強(qiáng)裂解液進(jìn)行裂解,提取總蛋白質(zhì),采用超微量紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度;每個(gè)樣品取50 μg總蛋白質(zhì)經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜[聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜]后用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉/洗膜緩沖液(TBST緩沖液)室溫?fù)u床封閉1 h,一抗結(jié)合4 ℃冰箱過夜;TBST洗滌3次后進(jìn)行二抗結(jié)合并在室溫?fù)u床孵育1 h,TBST洗滌3次;加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL),顯色1.5～2 min,采用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

HCC AM伴IVCTT患者臨床可表現(xiàn)為腰痛。影像學(xué)表現(xiàn)可表現(xiàn)為腎上腺區(qū)占位伴隨下腔靜脈內(nèi)充盈缺損，而缺乏肝臟原發(fā)腫瘤的表現(xiàn)。或者腎上腺轉(zhuǎn)移瘤與肝臟病變分界不清。當(dāng)影像學(xué)檢查同時(shí)發(fā)現(xiàn)肝臟病變和腎上腺病變時(shí)，常不易辨別原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶。泌尿系增強(qiáng)CT或MRI亦有誤診可能。診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為活檢或手術(shù)切除后的病理確診。患者既往史多有病毒性肝炎感染病史。

1.3 SENP1基因敲除細(xì)胞系構(gòu)建

本研究使用第三代慢病毒包裝體系,在HEK293T細(xì)胞系中包裝,經(jīng)過表達(dá)鑒定之后,使用0.1 mg/L PEG 8000濃縮,之后按照體積比1∶100加入病毒液和polybrene (8 μg/mL)感染黑色素瘤細(xì)胞。感染后12 h更換培養(yǎng)基。48 h后換入含puromycine的新鮮培養(yǎng)基,篩選14 d建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。所有細(xì)胞經(jīng)過WB檢測(cè)YAP蛋白(Yes associated protein,YAP)的含量。

1.4 SENP1對(duì)YAP的SUMO化修飾

采用RT-qPCR對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中的目標(biāo)基因的mRNA水平進(jìn)行驗(yàn)證,檢測(cè)是否符合轉(zhuǎn)錄水平的變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 DTIC處理8個(gè)月后顯著提升了黑色素瘤細(xì)胞的耐藥性

多功能微孔板檢測(cè)儀(Synergy HTX,Biotek,美國)、凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDocTMXRS+,Bio-rad,美國)、流式細(xì)胞儀(FACSCalibur,BD Biosciences,美國)、實(shí)時(shí)定量PCR儀(QuantStudioTM3 Real-Time PCR System,ABI,美國)。

圖1 黑色素瘤耐受性細(xì)胞株與對(duì)照組的差異

2.2 轉(zhuǎn)錄組分析揭示類泛素特異性蛋白酶SENP1在耐藥細(xì)胞株中表達(dá)量提升

為進(jìn)一步發(fā)掘DTIC耐受細(xì)胞中參與耐受機(jī)制相關(guān)的基因及信號(hào)通路,本研究針對(duì)耐藥型的黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375-DR、M14-DR以及對(duì)照組A375-WT及M14-WT進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄物組學(xué)分析(各包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù))。如圖2A所示,轉(zhuǎn)錄物組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),相比對(duì)照組,黑色素瘤耐藥性細(xì)胞株中有51個(gè)顯著上調(diào)及61個(gè)顯著下調(diào)的基因(fold change≥2,P<0.05)。類泛素蛋白質(zhì)修飾分子(small ubiquitin-like modifier,SUMO)是一類小泛素樣蛋白質(zhì)修飾物。其中,SENP1是泛素化和去泛素化過程中所需的關(guān)鍵蛋白酶,影響細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和凋亡狀態(tài),也是研究最深入并與腫瘤密切相關(guān)的SUMO化蛋白酶[7]。之前已有報(bào)道[8]表明SENP1與黑色素瘤的發(fā)生相關(guān),而本文研究轉(zhuǎn)錄物組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn),SENP1在耐受細(xì)胞株中發(fā)生了顯著上調(diào)(圖2A紅色箭頭所示)。通過京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析對(duì)差異基因進(jìn)行聚類分析,發(fā)現(xiàn)差異基因聚集于多個(gè)代謝途徑(圖2B)。其中,Hippo信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活、遷移、分化等關(guān)鍵過程,在器官發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮著重要作用[9]。其中,Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵基因YAP在DTIC耐受細(xì)胞株中同樣出現(xiàn)顯著上調(diào)。Vittoria等[10]發(fā)現(xiàn)Hippo抑制通路的失活可促進(jìn)黑色素瘤發(fā)展。而在筆者團(tuán)隊(duì)先前的研究[11]中,也發(fā)現(xiàn)YAP的激活有助于黑色素瘤的失巢凋亡抵抗和轉(zhuǎn)移。

圖2 對(duì)照組和耐藥性A375及M14細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組RNA-seq結(jié)果

2.3 Rt-qPCR及WB分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄物組學(xué)鑒定到的可能與黑色素瘤耐藥性相關(guān)的重要基因及信號(hào)通路,本研究采用Rt-qPCR及WB分析驗(yàn)證SENP1、YAP在不同細(xì)胞株中的表達(dá)情況。Rt-qPCR結(jié)果如圖3A及3B所示,無論對(duì)于A375還是M14黑色素瘤細(xì)胞株,耐受株的SENP1、YAP表達(dá)水平都出現(xiàn)顯著上調(diào)。其中,A375耐受株(A375-DR)相比對(duì)照組(A375-WT),SENP1相對(duì)表達(dá)量提升了2.2±0.12倍(P<0.001)而YAP相對(duì)表達(dá)量提升了0.7±0.1倍(P<0.01);相比對(duì)照組(M14-WT),M14耐受株(M14-DR)的SENP1相對(duì)表達(dá)量提升了1.7±0.14倍(P<0.001)、YAP相對(duì)表達(dá)量提升了2.5±0.18倍(P<0.01)。WB檢測(cè)同樣證實(shí)了相似的結(jié)論(圖3C)。以上結(jié)果表明SENP1、YAP在耐藥細(xì)胞株中表達(dá)量的確提升,且有可能與黑色素瘤的耐藥性相關(guān)。

圖3 Rt-qPCR及WB分析SENP1及YAP在不同細(xì)胞株中的表達(dá)量

2.4 SENP1參與黑色素瘤耐藥性并對(duì)YAP存在泛素化調(diào)控

為進(jìn)一步明確SENP1在黑色素瘤耐藥性中的作用,本研究構(gòu)建了表達(dá)空質(zhì)粒的細(xì)胞株A375-CT及SENP1敲除細(xì)胞株A375-SEKO,通過蛋白質(zhì)雜交確定A375-SEKO細(xì)胞株中SENP1的含量顯著下降(圖4A)。隨后,本研究測(cè)定了添加不同濃度DTIC下A375-CT和A375-SEKO的細(xì)胞活性。正如預(yù)期的那樣,盡管A375-CT和A375-SEKO的活力均隨著DTIC濃度的增加而下降,但A375-SEKO的活力下降速度明顯高于A375-CT(圖4B)。本文研究結(jié)果表明,SENP1參與了DTIC的耐受性的形成。最后,本文研究探究了SENP1與YAP之間是否存在相互作用。考慮到SENP1是泛素化修飾蛋白質(zhì),因此我們探究了SENP1對(duì)YAP的泛素化修飾作用。如圖4C所示,YAP與泛素B(HA-Ub)孵育顯著提高了其泛素化修飾程度。然而,與HA-Ub和SENP1共孵育后,YAP的泛素化修飾程度降低,表明SENP1可能調(diào)節(jié)YAP的去泛素化修飾作用。

圖4 SENP1敲除后細(xì)胞株DTIC耐藥性變化及其對(duì)YAP的去泛素化調(diào)控作用

3 討論

黑色素瘤起源于黑色素細(xì)胞的基因突變,可在皮膚、眼睛、內(nèi)耳和軟腦膜中發(fā)現(xiàn)[12]。黑色素瘤約占所有皮膚惡性腫瘤的1%,是最具侵襲性和最致命的皮膚癌[13]。對(duì)于Ⅰ～Ⅲ B期黑色素瘤患者,手術(shù)是主要的治療方法,此外還包括化療、放射性治療、免疫治療、靶向治療等[14]。除了由于藥物缺乏特異性導(dǎo)致皮膚和消化道毒性產(chǎn)生的不良反應(yīng)外[15],因病灶對(duì)化療等產(chǎn)生的耐藥性同樣是黑色素瘤治療目前面臨的困境[16]。因此,研究黑色素瘤耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制對(duì)于未來改善其化療治療效果具有重要意義。

收集廣東省惠州市第一人民醫(yī)院、惠州市中心人民醫(yī)院、惠州市第三人民醫(yī)院于2013年1月1日—2016年12月31日的面神經(jīng)炎住院患者合計(jì)882例作為研究對(duì)象。其中，惠州市第一人民醫(yī)院294例、惠州市中心人民醫(yī)院306例、惠州市第三人民醫(yī)院282例，診斷標(biāo)準(zhǔn)依照中國特發(fā)性面神經(jīng)炎診治指南[1]。

黃連對(duì)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑菌效果強(qiáng)于革蘭氏陰性菌大腸桿菌，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致。當(dāng)用不同溶劑提取時(shí)，黃連對(duì)2種試驗(yàn)菌的抑菌活性大小順序?yàn)榇继嵛铮?0%醇提物＞水提物；把黃連分成非生物堿、多糖、總堿時(shí)，發(fā)現(xiàn)這3種組分均有抑菌活性，其中總堿的抑菌活性最強(qiáng)，多糖的抗菌活性較弱。進(jìn)一步將總堿分離得到4種主要生物堿，其中小檗堿和黃連堿對(duì)2種試驗(yàn)菌的活性較強(qiáng)，并且4種主要生物堿之間可能存在協(xié)同抗菌關(guān)系。

蛋白質(zhì)泛素化修飾是維持底物蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要方式,對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用、亞細(xì)胞定位、基因轉(zhuǎn)錄的活性及靶蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性等具有重要的調(diào)節(jié)作用[17-18]。研究[19-20]表明,SENP1與腫瘤乏氧微環(huán)境、腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移及多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。除此之外,已有研究表明SENP1與腫瘤耐藥性相關(guān),如:Gao等[21]發(fā)現(xiàn)SENP1在肺癌細(xì)胞中異常過表達(dá),且其過表達(dá)對(duì)愛拉斯汀或順鉑處理的肺癌細(xì)胞具有保護(hù)作用;Chen等[22]研究發(fā)現(xiàn),在構(gòu)建的耐受伊立替康的人結(jié)腸癌細(xì)胞株中,SENP1蛋白質(zhì)大量積累;而SENP1的敲低降低了癌細(xì)胞的遷移能力,并再次觸發(fā)了其對(duì)伊立替康的敏感性。在本文研究中,發(fā)現(xiàn)SENP1在DTIC耐受的黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)量顯著上升,其很有可能在黑色素瘤的耐藥性中發(fā)揮了重要作用,本研究通過對(duì)其編碼基因進(jìn)行敲除進(jìn)一步確認(rèn)了其與耐藥性的相關(guān)關(guān)系。

Hippo信號(hào)通路最先在果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn),在哺乳動(dòng)物中具有高度保守性[9]。Hippo通路缺失或過度激活有可能導(dǎo)致細(xì)胞異常生長(zhǎng),進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)在肝癌、結(jié)直腸癌和肺癌等多種癌癥中Hippo通路相關(guān)基因通常發(fā)生異常表達(dá)并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。哺乳動(dòng)物Hippo信號(hào)通路的核心成分包括細(xì)胞質(zhì)激酶模塊和核轉(zhuǎn)錄模塊。其中,YAP屬于核轉(zhuǎn)錄模塊,具有促癌功能。在本文研究中,轉(zhuǎn)錄物組學(xué)鑒定到Hippo通路在黑色素瘤耐受細(xì)胞株中出現(xiàn)富集,表明該信號(hào)通路發(fā)生了顯著異常表達(dá)。其中,YAP表達(dá)的上調(diào)得到了Rt-qPCR及WB的驗(yàn)證。通過泛素化修飾實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,本文證實(shí)了SENP1對(duì)YAP存在泛素化修飾作用。綜上,本文研究構(gòu)建了DTIC耐受的黑色素瘤細(xì)胞株并通過轉(zhuǎn)錄物組學(xué)鑒定到了異常表達(dá)的SENP1基因及Hippo信號(hào)通路,證實(shí)了SENP1與黑色素瘤耐藥性相關(guān)并可調(diào)控YAP的泛素化。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明趙蓓:實(shí)驗(yàn)、撰寫及修改論文;施小琪、唐雪梅:數(shù)據(jù)處理及分析;程石:總體把關(guān),審定論文。