不同方法檢測(cè)食品中大腸埃希氏菌O 157:H 7/HM能力驗(yàn)證結(jié)果比較與分析

燕 妮，段 鵬，楊雅珺

（甘肅省食品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730300）

大腸埃希氏菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7）是一種能分泌志賀毒素的水和食源性人畜共患病原體，一旦感染會(huì)引起出血性腹瀉，嚴(yán)重者可發(fā)展為出血性結(jié)腸炎和出血性尿毒綜合征（HUS）[1-2]。美國(guó)和日本等國(guó)家均發(fā)生過(guò)由大腸埃希氏菌O157∶H7引起的不同規(guī)模的流行，我國(guó)江蘇、安徽等地也曾發(fā)生過(guò)大腸埃希氏菌O157∶H7引起的食物中毒事件，該病已成為世界性的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[3]。大腸埃希氏菌O157∶H7 的感染主要是由于食用被污染的家畜、家禽的肉類(lèi)、奶類(lèi)及蔬菜、水果及水源等引起，因而要大力加強(qiáng)對(duì)這類(lèi)產(chǎn)品的監(jiān)測(cè)，提升大腸埃希氏菌O157∶H7 的檢驗(yàn)檢測(cè)能力，防患于未然。我國(guó)陸續(xù)發(fā)布的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[4]、《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)散裝即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）[5]等國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定不得檢出大腸埃希氏菌O157∶H7。

能力驗(yàn)證是一種常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)的外部質(zhì)控手段，實(shí)驗(yàn)室通過(guò)定期參加能力驗(yàn)證，能有效提高實(shí)驗(yàn)室技術(shù)操作能力和分析鑒定能力，找出差距并加以改進(jìn)，從而提高實(shí)驗(yàn)室自身的檢驗(yàn)檢測(cè)能力，提供外部質(zhì)控考核結(jié)果，對(duì)全面提升食品檢驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)水平、保障食品安全具有重要意義[6-7]。筆者單位參加了中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心組織的食品中大腸埃希氏菌O157∶H7檢測(cè)能力驗(yàn)證項(xiàng)目，旨在提升對(duì)食品中大腸埃希氏菌O157∶H7 的檢驗(yàn)檢測(cè)能力。本次實(shí)驗(yàn)分別應(yīng)用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O157∶H7/NM檢驗(yàn)》（GB 4789.36—2016）第一法[8]和實(shí)時(shí)熒光PCR 方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，為大腸埃希氏菌O157∶H7的日常檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品23-F568 和23-G520，由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心發(fā)放；陽(yáng)性對(duì)照菌株∶大腸埃希氏菌（ATCC 25922），Microbiologics；陰性對(duì)照菌株∶大腸埃希氏菌O157∶H7（NCTC 12900），廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心；0.8%生理鹽水，實(shí)驗(yàn)室自制；改良EC 肉湯（mEC+n）、大腸埃希氏菌O157顯色培養(yǎng)基、改良山梨醇麥康凱瓊脂（CT-SMAC）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、革蘭氏染色液、大腸埃希氏菌O157∶H7干制生化鑒定試劑盒，均采購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-MUG（LST-MUG），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；革蘭氏陰性菌鑒定卡，法國(guó)生物梅里埃公司；大腸埃希氏菌O157 和H7 診斷血清，泰國(guó)Serotest；細(xì)菌DNA 提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；Premix Ex TaqTM（Probe qPCR），日本Takara；引物探針序列參考徐德順等[9]，見(jiàn)表1，由華大基因合成。

表1 引物探針序列

1.2 儀器與設(shè)備

高壓滅菌器，日本ALP公司；生化培養(yǎng)箱，德國(guó)美墨爾特公司；生物安全柜，新加坡藝思高科技有限公司；VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定儀，法國(guó)生物梅里埃公司；ViiA7 實(shí)時(shí)熒光PCR儀，美國(guó)ABI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品復(fù)原

根據(jù)組織方的參試指導(dǎo)書(shū)進(jìn)行，樣品用60 mL無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行再水化。為了防止樣品間交叉污染，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，建議有條件的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)不同樣品時(shí)分別在2 個(gè)生物安全柜中進(jìn)行，或2個(gè)樣品操作之間對(duì)生物安全柜進(jìn)行30 min 的紫外殺菌消毒[10]。

1.3.2 傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)方法

樣品的增菌、分離、初步生化實(shí)驗(yàn)、血清學(xué)鑒定、生化試驗(yàn)等步驟按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O157∶H7/NM 檢驗(yàn)》（GB 4789.36—2016）第一法操作，同時(shí)作陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。生化試驗(yàn)鑒定時(shí)自營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取分純的菌落，制成0.5 個(gè)麥?zhǔn)蠞岫鹊木鶆蚓鷳乙海偻ㄟ^(guò)生化鑒定試劑盒和VITEK 2 Compact全自動(dòng)菌種生化鑒定系統(tǒng)分別進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn)。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)

（1）DNA提取。取1 mL增菌后的mEC＋n肉湯加入到1.5 mL 無(wú)菌離心管中，10 000 r/min 離心1 min，將上清棄去，重復(fù)上述操作一次，然后根據(jù)細(xì)菌DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)DNA 提取；（2）實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系∶Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物各0.8 μL，探針1.0 μL，RoxⅡ0.4 μL，模板4 μL，ddH2O補(bǔ)齊至20 μL；擴(kuò)增反應(yīng)條件∶94 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸40 s，共45個(gè)循環(huán)，在60 ℃進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品菌落形態(tài)及初步生化反應(yīng)結(jié)果分析

結(jié)果顯示，樣品23-F568在CT-SMAC平板及大腸埃希菌O157顯色瓊脂平板上均無(wú)菌落生長(zhǎng)；而樣品23-G520在CT-SMAC平板及大腸埃希菌O157顯色瓊脂平板上均有2 種形態(tài)菌落生長(zhǎng)，其中1 種呈現(xiàn)大腸埃希氏菌O157∶H7的典型菌落形態(tài)，具體菌落形態(tài)和初步生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明樣品23-F568 中未檢出大腸埃希氏菌O157∶H7，而樣品23-G520 中有可疑菌落，還需通過(guò)進(jìn)一步生化實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。

表2 樣品菌落形態(tài)及初步生化反應(yīng)結(jié)果

2.2 血清學(xué)和生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 血清學(xué)試驗(yàn)

樣品23-G520的可疑菌落在O157血清和H7血清中出現(xiàn)明顯的凝集現(xiàn)象。

2.2.2 生化鑒定試劑盒試驗(yàn)

對(duì)樣品23-G520 的可疑菌落用生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3，再結(jié)合血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，表明樣品23-G520中檢出大腸埃希氏菌O157∶H7。

表3 樣品23-G 520可疑菌落生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 VITEK 2 Compact細(xì)菌生化鑒定儀試驗(yàn)

VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定儀檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4，結(jié)果顯示樣品23-G520 中檢出大腸埃希氏菌O157∶H7，且準(zhǔn)確度較高。采用全自動(dòng)菌種鑒定系統(tǒng)檢測(cè)時(shí)，應(yīng)選取在非選擇性培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24 h 左右的純化菌株，并將菌懸液調(diào)整到合適的麥?zhǔn)蠞岫确秶@樣才能獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表4 全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)

采用實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法對(duì)樣品23-F568、樣品23-G520、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照及空白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示樣品23-G520 及陽(yáng)性對(duì)照有特異性擴(kuò)增，而樣品23-F568及空白對(duì)照無(wú)特異性擴(kuò)增，陰性對(duì)照雖有特異性擴(kuò)增，但CT值大于30結(jié)果不可信，如圖1所示。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果可以確定樣品23-G520 中檢出大腸埃希氏菌O157∶H7，這與生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果一致。

圖1 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

能力驗(yàn)證活動(dòng)對(duì)檢驗(yàn)人員的操作能力和經(jīng)驗(yàn)要求較高，但除了檢驗(yàn)人員的技術(shù)因素外，影響能力驗(yàn)證結(jié)果的因素還有很多，如樣品的保存、樣品的水化、加樣的準(zhǔn)確度以及培養(yǎng)溫度和時(shí)間等[11-12]。因此，實(shí)驗(yàn)室做微生物能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)要注意以下幾點(diǎn)∶（1）在參加能力驗(yàn)證項(xiàng)目前，應(yīng)對(duì)所選項(xiàng)目的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)理解和掌握，提前備好檢驗(yàn)項(xiàng)目所需的培養(yǎng)基、試劑和耗材；（2）收到樣品后，如不立即進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)將樣品按《參試指導(dǎo)書(shū)》置于-15 ℃冷凍保存；（3）樣品檢驗(yàn)時(shí)要注意凍干粉是否完全水化，且水化后應(yīng)立即進(jìn)行檢驗(yàn)，避免放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)菌體死亡從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；（4）培養(yǎng)時(shí)要選擇溫度適宜、波動(dòng)較小的培養(yǎng)箱，避免因溫度不適宜對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。

此次能力驗(yàn)證活動(dòng)，實(shí)驗(yàn)室采用了常規(guī)生化鑒定試驗(yàn)結(jié)合VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物菌種鑒定系統(tǒng)對(duì)能力驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，再通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR 方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果反饋為滿(mǎn)意。傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)法使用傳統(tǒng)生化鑒定方法雖易于操作，但耗時(shí)較長(zhǎng)，人為干擾較大；采用VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物菌種鑒定系統(tǒng)可將生化鑒定時(shí)間由24~48 h縮短至4~7 h，且準(zhǔn)確率較高；與生化鑒定方法相比，實(shí)時(shí)熒光PCR方法操作簡(jiǎn)便省時(shí)，只需一步增菌就可進(jìn)行DNA 提取及實(shí)時(shí)熒光PCR 試驗(yàn)，省去了后續(xù)劃線(xiàn)、分離、培養(yǎng)、生化鑒定等一系列步驟，所需時(shí)間比傳統(tǒng)方法更短，且有較高的特異性和準(zhǔn)確度，但是檢測(cè)成本較高。各實(shí)驗(yàn)室可結(jié)合自身實(shí)際，選用適合自己的方法，或者多種方法互相驗(yàn)證，提高結(jié)果的準(zhǔn)確度。